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              膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的干細胞分選方法、以及分離膜.pdf

              摘要
              申請專利號:

              CN201510071373.2

              申請日:

              2012.03.30

              公開號:

              CN104673670A

              公開日:

              2015.06.03

              當前法律狀態:

              實審

              有效性:

              審中

              法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):C12M 3/06申請日:20120330|||公開
              IPC分類號: C12M3/06; C12N5/074(2010.01)I; C12N5/0775(2010.01)I 主分類號: C12M3/06
              申請人: 獨立行政法人國立長壽醫療研究中心; 東麗株式會社
              發明人: 中島美砂子; 庵原耕一郎; 山田和正; 島垣昌明; 長部真博
              地址: 日本愛知縣大府市
              優先權: 2011-075861 2011.03.30 JP
              專利代理機構: 中國專利代理(香港)有限公司72001 代理人: 龐立志; 李炳愛
              PDF完整版下載: PDF下載
              法律狀態
              申請(專利)號:

              CN201510071373.2

              授權公告號:

              |||

              法律狀態公告日:

              2015.07.01|||2015.06.03

              法律狀態類型:

              實質審查的生效|||公開

              摘要

              本發明涉及用于分選任意生物種類的干細胞和牙髓干細胞的膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的干細胞分選方法。膜分選培養器1,其含有上部結構體10和下部結構體13,所述上部結構體10由至少一部分含有具有干細胞透過用孔121的膜12的容器構成,所述下部結構體13由保持使所述上部結構體的膜浸漬于其中的量的流體的容器構成;膜分選培養試劑盒,其含有上述膜分選培養器1和細胞遷移因子;干細胞分選方法,其包括將樣本細胞或樣本組織接種于所述上部結構體10的膜12的步驟、將含有細胞遷移因子的培養基填充于所述下部結構體13的步驟、和使所述上部結構體10的膜12與所述下部結構體13中的培養基接觸的步驟;以及分離膜,其是具備基材膜和功能層的分離膜,所述基材膜由疏水性聚合物構成,所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上親水性聚合物通過共價鍵鍵合于所述基材膜的表面而成的功能層,構成所述功能層的親水性聚合物的重量為所述分離膜總重量的1.5重量%至35重量%。

              權利要求書

              權利要求書
              1.  膜分選培養器,其含有上部結構體和下部結構體,
              所述上部結構體由容器構成,該容器的底面的至少一部分用具有干細胞透過用孔的分離膜形成,
              所述下部結構體由容器構成,該容器保持使所述上部結構體的膜浸漬于其中的流體。

              2.  權利要求1所述的膜分選培養器,其中,所述分離膜具備基材膜和功能層,
              所述基材膜由疏水性聚合物構成,
              所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合于所述基材膜的表面而成的功能層,
              構成所述功能層的親水性聚合物的重量是所述分離膜總重量的1.5重量%至35重量%。

              3.  權利要求1或2所述的膜分選培養器,其中,所述孔的尺寸是3μm~10μm,密度是1×105~4×106孔/cm2。

              4.  權利要求1~3中任一項所述的膜分選培養器,其中,具備多個所述上部結構體,
              并進一步含有框體,所述框體容納于所述下部結構體中,且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板狀構件。

              5.  權利要求1或2中任一項所述的膜分選培養器,其中,具備多個所述上部結構體,
              并進一步含有框體,所述框體容納于所述下部結構體中,且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板狀構件,
              所述下部結構體由與所述該多個上部結構體的各個對應的多個容器構成。

              6.  權利要求4或5所述的膜分選培養器,其中,所述多個上部結構體具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜。

              7.  權利要求1~6中任一項所述的膜分選培養器,其中,進一步含有蓋狀結構體,所述蓋狀結構體可覆設或密封所述上部結構體和下部結構體。

              8.  權利要求7所述的膜分選培養器,其中,所述蓋狀結構體進一步含有氣體交換裝置,所述氣體交換裝置具備氣體導入口和氣體排出口。

              9.  權利要求7或8所述的膜分選培養器,其中,所述蓋狀結構體的至少一部分是由具有孔尺寸1~100nm的孔的膜形成的。

              10.  權利要求7~9中任一項所述的膜分選培養器,其中,在所述蓋狀結構體和所述下部結構體之間設置有密封用的彈性體。

              11.  權利要求7~10中任一項所述的膜分選培養器,其中,進一步具備含有溫度測定裝置和溫度調節裝置的溫度調節系統。

              12.  權利要求1~11中任一項所述的膜分選培養器,其中,所述下部結構體進一步含有具備培養基導入口和培養基送出口的培養基交換系統。

              13.  膜分選培養試劑盒,其含有權利要求1~12中任一項所述的膜分選培養器、和用于注入所述下部結構體的細胞遷移因子。

              14.  權利要求13所述的試劑盒,其中,所述細胞遷移因子是選自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原兒茶酸和血清中的一種以上。

              15.  權利要求13或14所述的試劑盒,其中,所述細胞遷移因子的濃度為1ng/ml~500ng/ml。

              16.  權利要求13所述的試劑盒,其進一步含有用于注入所述下部結構體的血清,所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF。

              17.  使用權利要求1~12中任一項所述的膜分選培養器的干細胞分選方法,其包括:
              將樣本細胞或樣本組織接種于所述上部結構體的膜的步驟、
              將含有細胞遷移因子的培養基填充于所述下部結構體的容器的步驟、和
              使所述上部結構體的膜與所述下部結構體中的培養基接觸的步驟。

              18.  權利要求17所述的方法,其中,所述細胞遷移因子是選自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原兒茶酸和血清中的一種以上。

              19.  權利要求17或18所述的方法,其中,所述細胞遷移因子的濃度為1ng/ml~500ng/ml。

              20.  權利要求17~19中任一項所述的方法,其中,將所述樣本細胞以相對于分離膜1mm2為3×102細胞~3×104細胞進行接種。

              21.  權利要求17所述的干細胞分選方法,其中,所述干細胞為牙髓干細胞,所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF,所述G-CSF或bFGF的濃度為50~150ng/ml,將所述樣本細胞以相對于分離膜1mm2為3×102~1.5×103細胞進行接種,或將所述樣本組織以相對于分離膜1mm2為0.1mg~1mg進行靜置,在所述含有細胞遷移因子的培養基中添加相對于該培養基的體積為5~20vol%的血清。

              22.  權利要求17所述的干細胞分選方法,其中,所述干細胞為骨髄干細胞或脂肪干細胞,所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF,所述G-CSF或bFGF的濃度為50~150ng/ml,將所述樣本細胞以相對于分離膜1mm2為3×102~1.5×103細胞進行接種,或將所述樣本組織以相對于分離膜1mm2為0.1mg~1mg進行靜置,在所述含有細胞遷移因子的培養基中添加相對于該培養基的體積為5~20vol%的血清。

              說明書

              說明書膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的干細胞分選方法、以及分離膜
              本申請是2012年3月30日提交的題為“膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的干細胞分選方法、以及分離膜”的PCT/JP2012/058637號發明專利申請的分案申請,原申請進入中國國家階段獲得的國家申請號為201280016688.1。
              技術領域
              本發明涉及用于分選任意生物種類的干細胞和牙髓干細胞的膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的干細胞分選方法。本發明特別涉及用于分選為了牙髓再生而填充于根管中的牙髓干細胞或間充質干細胞的膜分選培養器、膜分選培養試劑盒和使用其的干細胞分選方法。本發明還涉及分離膜、表面改性方法和利用其的分離膜的制造,提供不損害分離性能而將由疏水性聚合物構成的膜親水化以抑制將細胞透過分離時對膜的粘附的分離膜。因此,本發明適用于以血液凈化領域、再生醫療為中心的細胞分離純化領域中。另外,聚合物表面改性方法可以簡便地進行僅聚合物表面的改性,由于同時還可進行滅菌處理,因而與以往方法相比可有助于生產效率化。
              背景技術
              現在,拔髓治療或感染根管治療的生物學根管填充材料中所用的牙髓干細胞是血管新生能力、神經再生能力和牙髓再生能力優異的級分。主要使用的是來源于牙髓的CD31-SP(邊緣群)細胞、CD105+細胞或CXCR4+細胞等。SP細胞是用Hoechst33342標記,并通過流式細胞儀用Hoechst Blue和Hoechst Red來對強烈排出該色素的級分進行分選,大量含有干細胞。然而,由于Hoechst33342是DNA結合色素,而且必須使用流式細胞儀,因而人們認為在細胞的安全性方面存在問題。
              另一方面,開發有在使用針對干細胞特異性膜表面抗原的抗體時,不使用流式細胞儀而使用磁珠的方法。例如,作為骨髄干細胞,已知CD34或CD133抗體珠,但需要一定程度的組織細胞量。所以,不適于從牙髓組織進行分選的情形。另外,人牙髓的情形中,CD34陽性細胞和CD133陽性細胞分別為牙髓樣本細胞的0.01%和0.5%,基本不存在,因而現存(市售)的磁珠法不適合。對CD105或CXCR4的抗體珠來說,由于是定制品,因而有可能非常昂貴。另外,作為從脂肪組織分離干細胞的儀器,在臨床上已經使用了以利用酶消化法和離心分離法的細胞分離為基本的Celution 800/CRS系統,但需要大量組織,所得細胞為異源群體且多含前體細胞,而且昂貴。進而,作為從骨髄組織分離干細胞的儀器,商品化有Bone Marrow MSC Separation Device。據說其通過用由人造絲和聚乙烯形成的纖維來捕獲骨髄間充質細胞,從而可在短時間(20分)內采集干細胞,比較廉價,但卻需要比較大量的骨髄組織(髄液),所得細胞仍然為異源群體且多含前體細胞。因此,不使用酶消化法而從固體的組織分選干細胞并使之增殖的裝置尚未發明。
              另外作為膜分選器,可以將作為上部結構的插入式細胞培養皿(Cellculture Insert)(聚碳酸酯膜(Polycarbonate Membrane)Transwell(注冊商標) Inserts、2×105孔/cm2、孔尺寸 8 μm、底面的直徑6.4 mm、開口部的直徑11.0 mm、高度17.5 mm) (Corning)插入作為下部結構的24 孔板(直徑15.0 mm、開口部的直徑15.0 mm、高度22.0 mm) (Falcon)來使用。然而,對于PET膜或聚碳酸酯膜來說,細胞的附著多,無法有效地進行向下層的遷移。進而,由于是開放形狀,因而微生物所致的污染的危險大,無法保證細胞的安全性。
              因此,需要開發廉價且有效地從人牙髓組織或人牙髓細胞分選干細胞的方法。
              迄今為止,已知可以將骨髄中存在的CXCR4+細胞、C-MET+細胞或LIF-R+細胞分別利用其配體SDF1、HGF或LIF的濃度梯度,通過遷移趨化效果而濃縮為骨髄的干細胞(非專利文獻1)。
              另外,已知可以將骨髄、末梢血和臍帶血的干細胞(CXCR4+/lin-/CD133+/CD45+細胞的造血干細胞和CXCR4+/lin-/CD133+/CD45-細胞的間充質干細胞)通過SDF1的濃度梯度同樣地濃縮(非專利文獻2)。此時,在現成的Costar Transwell 24-孔的5μm孔徑(孔尺寸)的濾器下部的腔室中裝入SDF-1,在上部裝入欲要濃縮的細胞。然而,考慮安全性時,由于SDF-1還未受到藥事認可,因而期望使用替代SDF-1的安全且有效的遷移因子。
              另外,作為對骨髄干細胞的遷移有效的因子,已知來源于血小板的鞘胺醇-1-磷酸(S1P)(非專利文獻3),作為對脂肪干細胞的遷移有效的因子,已知原兒茶酸(非專利文獻4)。但是,仍然尚未解決安全性的問題。進而,還已知血管新生?神經再生和牙髓再生能力優異的牙髓CD31-SP細胞相對于SDF-1或VEGF遷移(非專利文獻5)。但是,目前對SDF-1以外的血管新生?神經再生和牙髓再生能力優異的牙髓干細胞的分選有效的遷移因子并不明確。
              能夠安全且實用地分選牙髓干細胞的膜分選培養器和遷移因子受到需求。另外,在人干細胞之外,各種生物種類中由干細胞分化誘導各組織的機理的闡明在生物學研究中受到追求。伴隨再生醫療的進展,能夠簡便且穩定地分選干細胞的膜分選培養器和遷移因子受到期待。
              對于與體液、血液或細胞接觸的醫療用的分離膜,若蛋白質或血小板、細胞等附著則分離膜的性能降低、或成為引起機體反應的原因,細胞自身的吸附也受到促進等,要解決的問題多。另外,凈水器等的水處理膜中,蛋白質或有機物的附著會引起分離膜的性能降低。對于上述問題,嘗試了通過將分離膜親水化來解決,進行各種研究。例如,公開了使作為親水性高分子的聚乙烯基吡咯烷酮與由聚砜形成的膜在制膜原液的階段混合并進行成形,由此對膜賦予親水性以抑制污垢的方法(專利文獻1)。然而,這些方法中,對表面賦予親水性時受到下述制約:需要增多制膜原液中的親水性高分子的量、或者限于與作為基材的高分子具有相容性的親水性高分子、或者對應于材料的使用用途必需研究最適的原液組成等。
              另外,專利文獻2中公開了將聚乙烯醇縮醛二乙基氨基乙酸酯和親水化試劑涂布于膜來實現親水化的方法。該方法中,有可能聚乙烯醇縮醛二乙基氨基乙酸酯被覆親水化試劑、非附著相關的效果驟減。另外,由于使膜浸漬于聚乙烯醇縮醛二乙基氨基乙酸酯和親水化試劑的各溶液中,因而膜的分離性能也有可能降低。
              公開了通過高能射線使要進行水不溶化的聚乙烯基吡咯烷酮等親水性成分水不溶化并導入所形成的膜中的方法(專利文獻3)、或使聚砜系的分離膜與聚乙烯基吡咯烷酮等親水性高分子溶液接觸后、通過放射線交聯而形成不溶化的被膜層的方法(專利文獻4)。然而,聚乙烯基吡咯烷酮等水性高分子和聚砜系高分子由于分子間的相互作用弱,因而存在難以形成被膜層的問題。
              因此,公開了使一定范圍的皂化度的聚乙烯醇水溶液與聚砜系分離膜接觸,通過聚砜和乙酸乙烯酯的疏水性相互作用而有效地形成膜表面的被膜層的方法(專利文獻5)。然而,該文獻并非關于附著抑制的方法,因而本發明人的研究結果得知,若將聚乙烯醇單純地被覆于分離膜,則分離膜的性能降低顯著。另外,已知聚乙烯醇的羥基在與血液接觸時容易將補體活化。
              進而,據說即使用聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇之類的親水性高分子被覆材料表面,附著抑制效果也僅能暫時性地抑制(非專利文獻6)。即,尚未確立用高性能的分離膜來滿足血液適合性的分離膜組件。
              現有技術文獻
              專利文獻
              專利文獻1:日本特公平2-18695號公報
              專利文獻2:日本特開平8-131791號公報
              專利文獻3:日本特公平8-9668號公報
              專利文獻4:日本特開平6-238139號公報
              專利文獻5:日本特開2006-198611號公報
              非專利文獻
              非專利文獻1:Kucia M., et al., Arch. Immunol. Ther. Exp. 2006
              非專利文獻2:Baumert B. et al., Folia Histochemica Et Cytobiologica 2008
              非專利文獻3:Meriane M., et al., Stem Cells 2006
              非專利文獻4:Wang H., et al., Eur. J. Pharmacol. 2008
              非專利文獻5:Iohara K.et al., STEM CELLS Volume 26, Issue 9, pages 2408-2418, September 2008
              非專利文獻6:醫療ナノテクノロジー 杏林圖書 pp115-116。
              發明內容
              發明要解決的技術問題
              以往的流式細胞儀或磁抗體珠法無法成為滿足臨床使用基準(藥品和準藥品的制造管理和品質管理的基準相關的部令(醫薬品及び醫薬部外品の製造管理及び品質管理の基準に関する省令)(GMP))的安全且高效、廉價的分選方法。本發明是鑒于上述問題而完成的發明,其目的在于針對牙髓再生治療和其它再生治療提供不使用流式細胞儀或磁抗體珠而由少量的組織也可以安全、高效且廉價地得到所期望的干細胞的培養器、用于其的遷移因子以及干細胞分選方法。進而,其目的在于提供能夠適用于所有生物種類的干細胞(胚胎干細胞、iPS細胞和組織干細胞)的分選的膜分選培養器、膜分選培養試劑盒和干細胞分選方法。
              本發明的進一步的目的在于提供改良了分離膜相關的現有技術的缺點,具有能夠在通常的細胞培養用孵育器、潔凈臺中使用的緊湊性,改良了基于孔徑的過濾性能以及表面親和性的高性能的分離膜。
              用于解決技術問題的方法
              本發明人為了達成上述課題而進行了深入研究,結果發現,利用細胞遷移因子的濃度梯度,可以使干細胞從膜上部至膜下部選擇性地通過,可以分選干細胞,從而完成了本發明。所以,根據一個方式,本發明是膜分選培養器,其含有上部結構體和下部結構體,所述上部結構體由容器構成,該容器的底面的至少一部分用具有干細胞透過用孔的分離膜形成,所述下部結構體由容器構成,該容器保持使所述上部結構體的膜浸漬于其中的流體。
              優選的是所述分離膜具備基材膜和功能層,所述基材膜由疏水性聚合物構成,所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合于所述基材膜的表面而成的功能層,構成所述功能層的親水性聚合物的重量為所述分離膜總重量的1.5重量%至35重量%。
              優選的是所述孔的尺寸為3μm~10μm,密度為1×105~4×106孔/cm2。
              優選的是具備多個所述上部結構體,并進一步含有框體,所述框體容納于所述下部結構體中、且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板狀構件。
              或者優選的是具備多個所述上部結構體,并進一步含有框體,所述框體容納于所述下部結構體中、且具備設置有將該多個上部結構體的各個固定的多個孔的板狀構件,所述下部結構體由于所述該多個上部結構體的各個對應的多個容器構成。
              或者還優選所述多個上部結構體具有不同孔尺寸和/或不同孔密度的膜。
              優選進一步含有蓋狀結構體,所述蓋狀結構體可覆設或密封上述上部結構體和下部結構體。
              優選所述蓋狀結構體進一步含有具備氣體導入口和氣體排出口的氣體交換裝置。
              優選所述蓋狀結構體的至少一部分是由具有孔尺寸1~100nm的孔的膜形成的。
              優選在所述蓋狀結構體和所述下部結構體之間設置有密封用的彈性體。
              優選進一步具備溫度調節系統,該溫度調節系統含有溫度測定裝置和溫度調節裝置。
              優選所述下部結構體進一步含有具備培養基導入口和培養基送出口的培養基交換系統。
              根據另一方面,本發明是膜分選培養試劑盒,其含有前述任一項中所述的膜分選培養器、和用于注入所述下部結構體的細胞遷移因子。
              優選所述細胞遷移因子是選自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原兒茶酸、和血清中的一種以上。
              優選所述細胞遷移因子的濃度為1ng/ml~500ng/ml。
              優選進一步含有用于注入所述下部結構體的血清,所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF。
              根據又一方面,本發明是使用上述任一膜分選培養器的干細胞分選方法,其包括:將樣本細胞或樣本組織接種于所述上部結構體的膜的步驟、將含有細胞遷移因子的培養基填充于所述下部結構體的容器的步驟、和使所述上部結構體的膜與所述下部結構體中的培養基接觸的步驟。
              優選所述細胞遷移因子是選自SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原兒茶酸、和血清中的一種以上。
              優選所述細胞遷移因子的濃度為1ng/ml~500ng/ml。
              優選將所述樣本細胞以相對于分離膜1mm2為3×102細胞~3×104細胞進行接種。
              另外,本發明為上述的干細胞分選方法,其中,所述干細胞為牙髓干細胞,所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF,所述G-CSF或bFGF的濃度為50~150ng/ml,將所述樣本細胞以相對于分離膜1mm2為3×102~1.5×103細胞進行接種,或將前述樣本組織以相對于分離膜1mm2為0.1mg~1mg進行靜置,在所述含有細胞遷移因子的培養基中添加相對于該培養基的體積為5~20vol%的血清。
              另外,本發明為上述的干細胞分選方法,其中,所述干細胞為骨髓干細胞或脂肪干細胞,所述細胞遷移因子為G-CSF或bFGF,所述G-CSF或bFGF的濃度為50~150ng/ml,將所述樣本細胞以相對于分離膜1mm2為3×102~1.5×103細胞進行接種,或將前述樣本組織以相對于分離膜1mm2為0.1mg~1mg進行靜置,在所述含有細胞遷移因子的培養基中添加相對于該培養基的體積為5~20vol%的血清。
              進一步地,本發明人為了實現與分離膜相關的上述課題而進行了深入研究,結果發現血液適合性優異、蛋白質或有機物的附著少的本發明的分離膜和分離膜組件通過下述的構成得以實現。
              即,根據其它的方式,本發明為一種分離膜,其具備基材膜和功能層,所述基材膜由疏水性聚合物構成,
              所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合于所述基材膜的表面而成的功能層,其中,構成所述功能層的親水性聚合物的重量是所述分離膜總重量的1.5重量%至35重量%。
              優選的分離膜中,所述基材膜具有1~10μm的孔,并用于細胞分離。
              優選所述疏水性聚合物選自砜系聚合物、酰胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烴系聚合物和酰亞胺系聚合物中。
              優選前述任一項所述的分離膜是用于將細胞透過分離。
              根據其它方面,本發明是上述任一項所述的分離膜的制造方法,其具備:將吸水率為2%以下的由疏水性聚合物構成的基材膜浸漬于含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上親水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的處理水溶液中的浸漬步驟、和對所述基材膜照射高能射線,將膜表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
              或者,本發明是上述任一項所述的分離膜的制造方法,其具備:將吸水率超過2%的由疏水性聚合物構成的基材膜浸漬于含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上親水性聚合物的水溶液中的浸漬步驟、和對所述基材膜照射高能射線,將膜表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
              優選所述疏水性聚合物選自砜系聚合物、酰胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烴系聚合物和酰亞胺系聚合物中。
              根據其它方面,本發明為成形體的表面改性方法,其具備:將吸水率為2%以下的成形體浸漬于含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上親水性聚合物、且含有0.01~0.2%的醇的處理水溶液中的浸漬步驟、和對所述成形體照射高能射線,將成形體表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
              或者本發明為成形體的表面改性方法,其具備:將吸水率超過2%的成形體浸漬于含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上親水性聚合物的水溶液中的浸漬步驟、和對所述成形體照射高能射線,將成形體表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。
              另外,本發明還是使用這些成形體的改性方法來制造上述任一項所述的分離膜的方法。
              發明效果
              根據本發明,使用膜分選培養器和細胞遷移因子,即使是由少量的細胞也可以安全、高效且廉價地分選干細胞。另外,通過對應于細胞的大小來選擇透過用孔的適合尺寸,可以廣泛用于所有生物種類的干細胞分選。或者,通過選擇適合的遷移因子,可以應對包括胚胎干細胞、iPS細胞和組織干細胞的所有干細胞的分選。進而,通過改變膜分選培養的分離膜的數量,還可以應對各種組織細胞量。通過使上部結構體和下部結構體為完全密封型,可以對應GMP,分選能在臨床上實際使用的干細胞。進而,本申請發明的膜分選培養器無論是作為實驗用還是作為臨床用,均可廣泛使用,極大地有助于再生醫療的發展。作為膜分選細胞的進一步的優點,特別是對于中老年人來說,膜分選的干細胞的擴增所伴隨的表型變化(phenotypical change )少。伴隨擴增,由于難以變老、難以老化,因而在臨床使用中可以有效地發揮功能。另外,作為膜分選器的進一步的優點,不僅可以從細胞、而且從組織也可分選干細胞,而不用預先通過酶消化等來分散細胞,這使得可以節約酶消化的時間和通過不使用酶來確保安全性。
              另外,本發明的分離膜是在分離細胞時抑制細胞發生粘附而使分離效率降低的分離膜,其特征在于,以聚合物狀局部化于分離膜功能層的表面。可適宜地用于抑制未向制膜原液中混合親水性聚合物而進行成型得到的分離膜、例如使電子射線透過而形成孔的膜表面的蛋白質或細胞附著性。
              附圖說明
              [圖1] 第一實施方式的膜分選培養器的模式圖。
              [圖2] 第二實施方式的膜分選培養器的模式圖。
              [圖3] 示出第三實施方式的膜分選培養器的構成的模式圖。
              [圖4] 示出第四實施方式的膜分選培養器的構成的模式圖。
              [圖5] 示出第五實施方式的膜分選培養器的構成的模式圖。
              [圖6] (a)是利用TaxiScan來顯示細胞遷移因子所致的狗CD105陽性細胞的遷移的差異、時間歷程的圖,(b)是利用TaxiScan來顯示細胞遷移因子G-CSF的各種濃度所致的狗CD105陽性細胞的遷移的差異的圖。
              [圖7] (a)是利用TaxiScan來顯示胎牛血清濃度變化所致的人牙髓樣本細胞的遷移的差異、時間歷程的圖,(b)是利用TaxiScan來顯示與胎牛血清相比的細胞遷移因子G-CSF和SDF-1(最終濃度100ng/ml)所致的人牙髓樣本細胞的遷移的差異的圖。
              [圖8] (a)是示出使用本發明的膜分選培養器(2×105孔/cm2、孔尺寸為3μm),將1×105細胞/250μl的狗新鮮初代牙髓細胞接種于分離膜上部,在分離膜下部結構體中于含10%狗血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,6小時后更換培養基除去G-CSF并進一步培養1天后的牙髓干細胞的圖,(b)是示出使用本發明的膜分選培養器(2×105孔/cm2、孔尺寸為3μm),將1×105細胞/250μl的狗新鮮初代牙髓細胞接種于分離膜上部,在分離膜下部結構體中于含10%狗血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,6小時后更換培養基,除去G-CSF并進一步培養7天后的牙髓干細胞的圖,(c)是示出使用本發明的膜分選培養器(2×105孔/cm2、孔尺寸為3μm),將1×105細胞/250μl的狗新鮮初代牙髓細胞接種于分離膜上部,在分離膜下部結構體于含10%狗血清的DMEM中加入SDF-1 100ng/ml,6小時后更換培養基,除去SDF-1并進一步培養1天后的牙髓干細胞的圖。
              [圖9] (a)是示出使用本發明的膜分選培養器和G-CSF進行分選培養得到的牙髓干細胞的第5代的試驗管內的血管誘導能力的圖,(b)是示出使用本發明的膜分選培養器和G-CSF進行分選培養得到的牙髓干細胞的第5代的試驗管內的神經球(neurosphere)形成能力的圖。
              [圖10] (a)是示出將使用本發明的膜分選培養器和G-CSF進行分選培養得到的牙髓干細胞移植至狗拔髓后的根管內,14天后的牙髓再生的圖,(b)是(a)的B所示位置的高倍圖,(c)是(a)的C所示位置的高倍圖,是示出沿根管內再生牙髓的牙本質側壁分化并排列的成牙本質細胞的高倍圖。(d)是示出相同年齡、相同部位的狗的正常牙髓的圖。
              [圖11] 是示出使用本發明的膜分選培養器(2×105孔/cm2、孔尺寸為3μm),將1×105細胞/250μl的人新鮮初代牙髓細胞接種于分離膜上部,在分離膜下部結構體中于含10%人血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,6小時后更換培養基,除去G-CSF并進一步培養8天后的人牙髓干細胞的圖。
              [圖12] (a)是示出使用本發明的膜分選培養器(1×105孔/cm2、孔尺寸為8μm),將1×105細胞/100μl的人新鮮初代牙髓細胞接種于分離膜上部,在分離膜下部結構體中加入含10%人血清的DMEM,22小時后更換培養基,并進一步培養3天后的分選得到的人牙髓干細胞的圖,(b)是示出使用相同的膜分選培養器,將1×105細胞/100μl的人新鮮初代牙髓細胞接種于分離膜上部,在分離膜下部結構體中于含10%人血清的DMEM中加入G-CSF 10ng/ml,22小時后更換培養基除去G-CSF并進一步培養3天后的人牙髓干細胞的圖,(c)是示出使用相同的膜分選培養器,將1×105細胞/100μl的人新鮮初代牙髓細胞接種于分離膜上部,在分離膜下部結構體中于含10%人血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,22小時后更換培養基除去G-CSF并進一步培養3天后的人牙髓干細胞的圖。(d)是示出(a)的10%人血清的培養7天后的人牙髓干細胞的圖。(e)是示出(c)的G-CSF 100ng/ml的培養7天后的人牙髓干細胞的圖。
              [圖13] (a)是示出使用本發明的膜分選培養器(1×105孔/cm2、孔尺寸為8μm),將1×105細胞/100μl的豬新鮮初代牙髓細胞接種于分離膜上部,在分離膜下部結構體中于含10%胎牛血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,22小時后更換培養基除去G-CSF并進一步培養3天后的豬牙髓干細胞的圖,(b)是示出替代(a)中的豬新鮮初代牙髓細胞而接種豬新鮮初代骨髄細胞,進行膜分選并培養3天后的豬骨髄干細胞的圖,(c)是示出替代(a)中的豬新鮮初代牙髓細胞而接種豬新鮮初代脂肪細胞,并培養3天后的豬脂肪干細胞的圖。(d)是示出接種(a)中的豬新鮮初代牙髓細胞,進行膜分選并培養8天后的豬牙髓干細胞的圖。
              [圖14] 是示出取決于各種遷移因子的未分選的人牙髓樣本細胞的遷移能力的比較的圖。
              [圖15] 是示出取決于制劑化的遷移因子和血清的人牙髓樣本細胞的遷移能力的比較的圖。
              [圖16] 是示出使用各種濃度的G-CSF進行分選得到的牙髓膜分選細胞的、取決于人血清的細胞增殖能力的比較的圖。
              [圖17] 是示出使用各種濃度的G-CSF進行分選得到的牙髓膜分選細胞的、取決于100ng/ml的G-CSF的細胞增殖能力的比較的圖。
              [圖18] 是示出使用各種濃度的G-CSF進行分選得到的牙髓膜分選細胞的、相對于G-CSF的細胞遷移能力的比較的圖。
              [圖19] 是示出使用100ng/ml的G-CSF進行分選得到的牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞的、相對于胎牛血清的細胞增殖能力的、與樣本細胞的比較的圖。
              [圖20] 是示出使用100ng/ml的G-CSF進行分選得到的牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞的、相對于100ng/ml的G-CSF的細胞增殖能力的、與樣本細胞的比較的圖。
              [圖21] 是示出使用100ng/ml的G-CSF進行分選得到的牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞的、相對于G-CSF的遷移能力的、與樣本細胞的比較的圖。
              [圖22] 是示出第六實施方式的膜分選培養器的構成的模式圖。
              [圖23] (a)是示出使用本發明的膜分選培養器(1×105孔/cm2、孔尺寸為8μm),將2mg/200μl的切碎的狗新鮮牙髓組織靜置于膜上部,并在膜下部結構體中于含10%血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,24小時后的牙髓干細胞的圖,(b)是示于與(a)同樣地將2mg/200μl的切碎的狗新鮮脂肪組織靜置于膜上部,并在膜下部結構體中于含10%血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,24小時后的脂肪干細胞的圖。
              具體實施方式
              以下參照附圖詳細地說明本發明。但以下說明并不限定本發明。
              (第1實施方式)
              本發明的第1實施方式的膜分選培養器1由上部結構體10和下部結構體13構成。上部結構體10是用于加入含有樣本細胞200或樣本組織的培養基100,并將樣本細胞200或樣本組織保持在分離膜12上的結構體。另一方面,下部結構體13是用于加入含有遷移因子(未圖示)的培養基300,并接收遷移的干細胞的結構體。
              上部結構體10是由側面部11和圓形的底面部構成的容器,底面部由具有多個孔121的分離膜12形成。上部結構體10只要其內部可以容納培養基100和樣本細胞200或樣本組織即可。本說明書中,樣本細胞是指通過酶處理從組織將細胞間的粘附解散且未進行分選的細胞。或者是指傳代并分散的細胞。例如,優選可以容納100~250μl左右的培養基100和樣本細胞200的容器。樣本組織是指切碎的但未進行酶消化處理的未分散的組織。
              構成上部結構體10的底面的分離膜12具有用于使干細胞透過的多個孔121。孔尺寸為1μm~100μm、優選為3μm~10μm、進一步優選為5μm~8μm。這是為了使干細胞能夠通過。另外,孔密度為2.5×103~2.5×107孔/cm2、優選為1×105~4×106孔/cm2。為了使干細胞能夠高效地通過,開孔率可以盡可能地高。
              作為分離膜12的材料,優選使用以PET、聚碳酸酯、聚砜、聚丙烯、聚偏氟乙烯、聚酰胺等疏水性聚合物為基材的材料。另外,分離膜12的厚度優選為10~100μm、進一步優選為10~25μm。這是為在干細胞遷移時,特別是在干細胞通過孔時,不對干細胞表面造成損傷。
              對于分離膜12,為了形成為細胞非粘附性,優選為利用涂覆劑對分離膜表面進行了涂覆的分離膜。特別地,可以在在接種樣本細胞200或樣本組織時,向作為與樣本細胞200或樣本組織接觸的面的、上部結構體10的內側的面適用涂覆劑。作為涂覆劑,可使用已知的細胞非粘附性的涂覆劑,例如,將環氧乙烷/環氧丙烷共聚物(旭電化工業(旭電化工業)株式會社的商品名:Pluronic F108)、聚甲基丙烯酸2-羥基乙酯以達到5mg/ml的方式溶解于95%乙醇中而得的涂覆劑(Folkman J&Moscona A,Nature 273:345-349,1978、日本特開平8-9966號公報等)、分支聚亞烷基二醇衍生物(WO2009/072590)等,但并不限定于此。可以使用任意的細胞非附著性的涂覆劑。涂層厚度只要是足以對PET、聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等基材膜賦予細胞的非粘附特性的范圍即可。這樣的厚度也根據涂覆劑的種類而不同,例如,優選為10~100μm,進一步優選為10~25μm。
              對分離膜12的特別優選的修飾方法進一步進行說明。上述使用涂覆劑的方法中,由于有可能使分離膜的孔閉塞、或因水系培養液而發生溶出等有機溶劑殘存造成對細胞的不良影響,因而優選進行以下所述的利用共價鍵合法的分離膜表面修飾。
              即,將所期望的孔徑且以高開孔率開口的由疏水性聚合物構成的基材膜浸漬于添加有乙烯基吡咯烷酮系聚合物、乙二醇系聚合物和/或乙烯醇系聚合物、和根據需要的醇的處理水溶液中后,照射高能射線,由此進行表面修飾,制造分離膜。
              聚乙烯基吡咯烷酮系聚合物是指選自聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮?乙酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮?乙烯醇共聚物、乙烯基吡咯烷酮?苯乙烯共聚物、乙烯基吡咯烷酮?二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯共聚物和它們的改性聚合物中的聚合物,乙二醇系聚合物也包括側鏈含有酯基的那些。乙烯醇系聚合物可根據皂化度而獲得各種種類,并無限定。其中,這些膜表面修飾聚合物優選為水溶性。因此,例如,可以使用數均分子量為1萬至100萬的聚合物,但只要為水溶性則并不限于上述分子量。該處理水溶液中的聚吡咯烷酮系聚合物的濃度優選為10~5000ppm。若濃度變高,則有時會閉塞孔,因而更優選為10~2000ppm。
              另外,為了有效地進行基材膜的表面修飾,在基材膜的吸水率為2%以下時,優選在該處理水溶液中進一步添加醇。應予說明,基材膜的吸收率是指,將100μm以下的膜厚的基材膜浸漬于23℃水中24小時,測定重量增加量,將該重量增加率的值定義為吸水率。
              作為在吸水率為2%以下時添加的醇,若考慮殘留時的安全性,則優選為乙醇,但并不限定于此。相對于處理水溶液的重量,醇的濃度優選為1重量%以下,為了安全則為0.5重量%以下、進一步優選為0.1重量%以下。
              作為高能射線,可使用UV、電子射線、γ射線中的任一者,電子射線或γ射線容易提高反應率,因而更優選。照射的射線量優選為5~35kGy,特別是將培養裝置整體用例如相當于被視為滅菌射線量的25kGy的射線量進行照射,由此還可以同時實施表面修飾和滅菌。
              這樣得到的分離膜從細胞非附著性的觀點來看是有用的,可以有效地用于本實施方式中的膜分選裝置。
              作為上部結構體10的側面部11的材料,可以使用通常用作細胞培養器的常規材料,可以設定為聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯、聚丙烯(PP)、聚碳酸酯等塑料制。
              上部結構體10的尺寸并不限于特定的大小,例如,可將底面部的直徑設為5~8mm。由側面部11的上端規定的容器開口部的直徑可以設為例如6~10mm。從底面部12至開口部的高度、即容器的深度可以設為例如10~15mm。應予說明,上述值為一例,本領域技術人員可以根據樣本細胞、樣本組織的種類、或收集的干細胞的種類等目的而適宜確定構成上部結構體10的容器的尺寸。
              接著,下部結構體13是由底面部和側面部構成、且上面具有開口部的容器。作為下部結構體13的材料,側面和底面均可使用相同的材料,優選使用聚苯乙烯、玻璃等。這是為了賦予細胞附著性、細胞增殖性。應予說明,下部結構體不必將底面部和側面部固定而成為一體,根據實施方式,也可以用與下部結構體不同的其它構件來構成下部結構體的底面部。
              下部結構體13能夠可裝卸地裝載上部結構體10。進行裝載時,構成上部結構體10的容器的分離膜12容納于下部結構體13中。這是為了在后述干細胞分選方法中,使加入下部結構體13的培養基和構成上部結構體10的分離膜12接觸,從而細胞能夠通過分離膜的兩側。在圖示的實施方式中,分離膜12不與下部結構體13的底面相接,在分離膜12和下部結構體13的底面部之間形成有空隙。可以在該空隙填充培養基。
              為了將下部結構體13與上部結構體10的裝載時的位置關系固定,可以進一步具有未圖示的保持機構。保持機構可以設置于上部結構體10或下部結構體13的一方,也可設置于雙方。作為保持機構,例如,可以是從上部結構體10的側面上端或側面的規定高度起、向開口部的外側延伸的凸緣或爪狀的構件。該保持機構與下部結構體13的側面上端相接,可以將上部結構體10保持于規定的高度。作為保持機構的其它例子,可以是設置于上部結構體10,由上部結構體10的底面向下延伸的腳狀的構件。該保持機構與下部結構體13的底面相接,可以將上部結構體10保持于規定的高度。此時,在下部結構體的底面上還可以設置嵌合于上述腳狀的構件而進行固定的構件。
              作為下部結構體13的尺寸的一例,在與上述上部結構體10的尺寸的關系上,例如,可以將底面部的直徑設為7~15mm。另外,由下部結構體13的側面部的上端規定的容器開口部的直徑的尺寸也可以同樣設定。下部結構體13的深度優選比上部結構體10的深度更深,例如,可以設為11~20mm。
              應予說明,本實施方式中,將具有圓形的底面和開口部、且底面的直徑比開口部的直徑更小的形狀的上部結構體作為一例進行說明,但底面部12的形狀并不限定于圓形,可以設為楕圓形、方形、多邊形、或任意的形狀。另外,底面部的尺寸和開口部的尺寸的關系也不限定于本實施方式所述,底面部和開口部的尺寸也可以相同。進而,對于上部結構體,只要其底面的至少一部分具有包含多個孔的分離膜,且可以在分離膜上接種并保持細胞,則可以構成為含有底面和側面連續的球體的部分面。另外,本實施方式中,下部結構體13是以圓形為一例進行說明,但底面和開口部的形狀并不限定于特定形狀。進而,下部結構體不必是底面與側面可以明確區別的結構體,也可以構成為含有底面和側面連續的球體的部分面。
              這樣的膜分選培養器1可用于從包括哺乳類的任意的生物組織或細胞中分選干細胞。作為可分選的干細胞,可舉出例如:胚胎干細胞、iPS細胞和組織干細胞。特別地,為了再生包括人的哺乳類的牙髓,可用于從牙髓細胞或間充質細胞分選牙髓干細胞或間充質干細胞。間充質干細胞包括例如:骨髄干細胞、脂肪干細胞、羊膜干細胞、臍帶血干細胞。但是,本實施方式的膜分選培養器1的用途并不限于上述。
              具體地,作為分選目標的前述牙髓干細胞或其它組織干細胞優選含有下述中的至少任一種:來源于牙髓或其它組織(例如骨髄、脂肪組織、羊膜、牙根膜、滑膜、臍帶)的CD105陽性細胞、CXCR4陽性細胞、SSEA-4陽性細胞、FLK-1陽性細胞、CD31陰性且CD146陰性細胞、CD24陽性細胞、CD150陽性細胞、CD29陽性細胞、CD34陽性細胞、CD44陽性細胞、CD73陽性細胞、CD90陽性細胞、FLK-1陽性細胞、G-CSFR陽性、和SP細胞。前述SP細胞優選為下述中的任一種:CXCR4陽性、SSEA-4陽性、FLK-1陽性、CD31陰性且CD146陰性、CD24陽性、CD105陽性、CD150陽性、CD29陽性細胞、CD34陽性細胞、CD44陽性細胞、CD73陽性細胞、CD90陽性細胞、FLK-1陽性或G-CSFR陽性。
              接著,從干細胞分選方法的觀點來說明本實施方式的膜分選培養器1。干細胞分選方法包括:在上部結構體10的分離膜12上接種樣本細胞200或樣本組織的步驟、向下部結構體13注入含有細胞遷移因子的培養基300的步驟、和使分離膜12與培養基300接觸的步驟。通過這些步驟,利用加入下部結構體13的細胞遷移因子的濃度梯度,可以選擇性地使干細胞從分離膜12上部通過,可以分選干細胞。
              在上部結構體10的分離膜12上接種樣本細胞200或樣本組織的步驟中,使可通過已知方法,例如,Nakashima,Archs oral Biol 36,1991獲得的樣本細胞200溶解于培養基100,并接種于上部結構體10的分離膜12上。作為用作干細胞的分選源的樣本細胞200,可舉出牙髓細胞或間充質細胞。間充質細胞包括來源于骨髄、脂肪組織、羊膜、牙根膜、滑膜、臍帶的細胞,但并不限定于此。另外,在分選胚胎干細胞、iPS細胞時,作為用作分選源的樣本細胞200,可以使用胚和胚泡、實施了基因導入或蛋白導入等的體細胞。使用樣本組織時,切碎后浸漬于培養基,并靜置于上部結構體10的分離膜12上。
              樣本細胞以相對于分離膜1mm2為3×102細胞~3×104細胞進行接種。例如,相對于直徑6.5mm的分離膜,細胞密度優選為1×102細胞/100μl~1×107細胞/100μl,進一步優選為1×104細胞/100μl~1×106細胞/100μl。這是因為若細胞密度過低則難以增殖,若過高則難以遷移。應予說明,根據要分選的干細胞的種類,所需的樣本細胞的量有所不同,例如,分選1×103細胞的牙髓干細胞時所需的來源于牙髓組織的樣本細胞極其少量,為例如1×105細胞左右即可。特別地,分選牙髓干細胞時的最優選的樣本細胞的密度為3×102~1.5×103細胞/mm2。另一方面,分選等量的骨髄干細胞或脂肪干細胞時所需的樣本細胞例如有時分別需要為3×105細胞和1×106細胞左右。另外,分選iPS細胞時,樣本細胞200的量根據導入效率而不同。這種所需的樣本細胞的量對于本領域技術人員來說是已知的,可以適宜決定。另外,使用樣本組織時,可以將樣本組織以相對于分離膜1mm2為0.1mg~1mg進行靜置。
              在向下部結構體13注入含有細胞遷移因子的培養基300的步驟中,使細胞遷移因子溶解于培養基并注入下部結構體13。加入下部結構體13的添加于培養基的細胞遷移因子優選為選自下述中的至少任一者:SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原兒茶酸、和血清。特別地,從遷移活性和臨床使用中的安全性的觀點出發,最優選G-CSF或bFGF。另外,前述細胞遷移因子的濃度優選為1ng/ml~500ng/ml。這是因為若過于稀薄則有時會沒有遷移效果,若過濃則干細胞有可能發生分化。特別地,將G-CSF或bFGF用作細胞遷移因子時,G-CSF或bFGF的濃度優選為50~150ng/ml,特別優選為約100ng/ml左右、例如95~105ng/ml。這是為了能夠分選最多的干細胞,并且在分選得到的干細胞中,血管新生因子、神經營養因子的mRNA表達也達到高值。
              作為使用的培養基,可以使用Dulbecco's改良Eagle培養基、EBM2等,但并不限定于此。可以是能夠在干細胞的培養中使用的任意的培養基。培養基的量可根據下部結構體13的容量而適宜決定。在培養基中優選與細胞遷移因子一起添加血清。這是因為血清具有促進細胞遷移活性的效果。為了分選人干細胞,優選使用人血清,也可以使用胎牛血清。相對于培養基的體積,血清的添加量優選設為5~20vol%。
              在使分離膜12與培養基300接觸的步驟中,使上部結構體10層疊于下部結構體13,使分離膜12的外側與培養基300充分接觸。由此,可以產生細胞遷移因子的濃度梯度。作為其結果,樣本細胞200或樣本組織中的干細胞通過孔121,向下部結構體13遷移,從而可進行干細胞的分選。接觸后的作用時間優選設為40~50小時。
              應予說明,上述中,采用向上部結構體10中加入樣本細胞200或樣本組織、向下部結構體13中加入含有細胞遷移因子的培養基、然后將上部結構體10裝載于下部結構體、使分離膜12與培養基接觸的方式進行了說明,但上述三步驟的順序并無限定。組合上部結構體10和下部結構體13后,可以分別進行接種、注入,也可以實質上同時進行。
              應予說明,該干細胞培養方法也可以不依賴于特定的容器形狀而實施,此時,干細胞培養方法包括:使樣本細胞或樣本組織與具有孔的分離膜的細胞非粘附性的面接觸的步驟、和使含有細胞遷移因子的培養基與前述分離膜的另一面接觸的步驟。
              根據本實施方式的膜分選培養器1和使用其的干細胞分選方法,可以安全且有效地分選干細胞。
              根據第二實施方式,本發明為具備氣體交換系統和培養基交換系統的膜分選培養器。圖2是本實施方式的膜分選培養器2的概念圖。膜分選培養器2除了上部結構體20和下部結構體23之外,還含有蓋狀結構體24。
              上部結構體20和下部結構體23的基本結構、材料和功能如第一實施方式中說明所述。本實施方式中,下部結構體23進一步具備培養基導入口231和培養基送出口232。它們構成培養基交換系統。培養基導入口231和培養基送出口232是將下部結構體23的容器內部和外部連通的開口部。通過該開口部,可以將細胞遷移因子和/或含有分選的干細胞的培養基在下部結構體23和外部之間連通。即,可以從培養基送出口232獲得含有分選的干細胞的培養基d,可以從培養基導入口231送入含有細胞遷移因子的新鮮培養基c。因此,培養基導入口231和培養基送出口232可以與未圖示的管連接。通過這樣的培養基的更換機構,從而具有下述優點:通過能夠適應GMP的非開放體系(密封體系)從而避免細菌或病毒、支原體感染,安全性和效率得到提高。
              另一方面,蓋狀結構體24裝載于上部結構體20,是覆蓋上部結構體20的開口部和下部結構體23的開口部的蓋狀結構體。蓋狀結構體優選為與下部結構體23、或與上部結構體20和下部結構體23兩者密合,將膜分選培養器2密閉而隔離外界空氣。為了進行密閉,下部結構體23的側面上端可以具備橡膠或有機硅制的墊片。
              蓋狀結構體24進一步具備氣體導入口241和氣體排出口242。它們構成氣體交換系統。氣體導入口241和氣體排出口242是將蓋狀結構體的內部與外部連通的開口部。氣體導入口241和氣體排出口242可以與未圖示的管連接。例如,可以從氣體導入口241向膜分選培養器2內部送入CO2、N2等惰性氣體a,從氣體排出口242排出含有CO2等的使用完的氣體b。
              蓋狀結構體24中,可以進一步具備設置有孔尺寸為100nm以下、特別為1~100nm、優選為10~100nm的多個孔的有機硅膜。在蓋狀結構體中,有機硅膜可以以覆蓋氣體導入口241和氣體排出口242的方式設置。這是為了隔絕來自外部的支原體的侵入路徑。具備這樣的氣體交換系統24具有下述優點:通過能夠適應GMP的非開放體系(密封體系)而使安全性、效率以及存活率提高。
              本實施方式的膜分選培養器還可具備未圖示的溫度調節系統。溫度調節系統由測定經密封的膜分選培養器2的內部的溫度的溫度測定裝置、和從膜分選培養器2的外部對膜分選培養器2進行加熱或冷卻的加熱?冷卻裝置構成。通過具備溫度調節系統,例如,對下部結構體23使用溫度敏感性的培養基系統,也可以進行溫度調節管理。
              應予說明,本實施方式中,對具備培養基的更換機構和氣體交換系統24兩者的膜分選培養器2進行了說明,但本發明的膜分選培養器并不限定于此,也可以是具備任一者的培養器。根據第2實施方式的膜分選培養器2,可以更安全、且以循環方式進行無需特別更換培養基的培養,可以高效地獲得適于組織再生的干細胞。
              根據第三實施方式,本發明是具備蓋狀結構體的膜分選培養器。圖3是示出本實施方式的膜分選培養器3的構成的概念圖。膜分選培養器3除了上部結構體30和下部結構體33之外,還含有蓋狀結構體34。
              本實施方式中,上部結構體30是由具有圓形底面的軸狀部和具有開口部的圓錐臺形部構成的一個容器。上部結構體30構成為開口部的直徑大于底面的直徑。圓錐臺形部的開口部具備由向外側突出的凸緣構成的保持機構35。
              圖示的下部結構體33是具備直徑相同的圓形底面和開口部的筒狀構件。開口部附近具備溝,溝中保持有密封用的彈性體331。溝可以是一條也可以是兩條。此時使用的密封用的彈性體的材質理想的是如有機硅橡膠等那樣組成明確的合成橡膠等。另外,在圓筒的中央部附近、且在設置有彈性體331的溝和底面之間,具備由從圓筒的內壁面向內側突出的凸緣構成的保持機構335。保持機構335與上部結構體30的保持機構35嚙合,將上部結構體30保持于下部結構體33內部的規定位置。
              上部結構體30和下部結構體33的上述以外的基本結構、材料和功能如第一實施方式中說明所述。
              蓋狀結構體34是可以覆設或密封前述上部結構體30和下部結構體33的構件。蓋狀結構體34只要可以從上部結構體30的上方覆蓋上部結構體30和下部結構體33的開口部即可,其材質為與第一實施方式中說明的下部結構體相同的材質。理想的是蓋狀結構體34中進一步具備氣體交換機構(未圖示)。作為該氣體交換機構,例如,可以是設置于蓋狀結構體34的整個面或一部分的孔尺寸為100nm以下、特別為1~100nm、優選為10~100nm的多個孔。作為其它例子,可以在蓋狀結構體34的至少一部分設置例如氣體管道濾器用的四氟乙烯(PTFE)層合膜那樣的基于高分子膜的氣體透氣膜。應予說明,蓋狀結構體34可以進一步具備如第二實施方式中說明所述的氣體導入口和氣體排出口。
              蓋狀結構體34與下部結構體33組合時,可以與保存于前述下部結構體33的溝的彈性體331密合。通過該構成,可簡單地實施密封,通過進一步具備氣體交換功能(未圖示),則提供不對干細胞賦予壓力變化的結構。
              具備本實施方式的這種蓋狀結構體34和下部結構體33具有下述優點:在覆設的情形中降低污染的危險率,在密封的情形中避免例如支原體等的污染,還避免溫度變化導致的壓力變化。
              根據第四實施方式,本發明是具備多個上部結構體而成的膜分選培養器。圖4是示出本實施方式的膜分選培養器4的構成的概念圖。膜分選培養器4含有:多個前述上部結構體40、固定多個前述上部結構體40的框體45、以及下部結構體43,所述下部結構體43由容器構成,該容器共同地保持使多個前述上部結構體40的分離膜浸漬于其中的流體。
              本實施方式中,各上部結構體40的結構可以與第三實施方式相同。多個上部結構體40各自可以具備不同孔尺寸和/或孔密度的分離膜,或者可以全部相同。
              框體45是容納于下部結構體43中的結構體,并且將多個上部結構體40分別支持于各孔451。即,框體45是具備多個孔451的、上下開口的構件,所述孔451設置于通過保持機構453保持于距離下部結構體40一定高度的板狀構件上。格子狀的隔室452將板狀構件上側的區域分割開而形成分隔,一個分隔中存在一個孔451。框體45的材質可以與第一實施方式中說明的下部結構體相同。另外,保持機構453是從板狀構件的邊緣向下方延伸的腳狀構件。保持機構453僅在板狀構件的邊緣以外框的形式形成,在與板狀構件上側的隔室452對應的位置,形成有狹縫(slit)。圖4示出了具有24個孔的框體45的結構,框體45的孔數可以是2孔也可以是96孔,孔數并無限定。另外,設置于框體24的板狀構件上的孔的配置也不限于圖示的方式。另外,本實施方式中的保持機構453是從板狀構件向下延伸的腳狀構件,也可以設置從下部結構體的內壁向內側延伸的凸緣而卡于其中。
              能夠將上部結構體40可裝卸地插入框體45的各孔451中。插入上部結構體40時,以構成上部結構體40的底面的分離膜位于孔451與下部結構體43的底面內壁之間的方式,孔451將上部結構體40固定。即,形成為孔451的直徑大于上部結構體40的底面的直徑,且小于開口部的直徑。
              下部結構體43是可裝卸地容納框體45的容器。下部結構體43中設置有一條溝。溝中設置有第三實施方式中說明的彈性體431。這是為了與后述的蓋狀結構體44密合,以密閉膜分選培養器4的內部。其它的下部結構體43的結構、材料和功能如第一實施方式中說明所述。另外,下部結構體43還可以具備培養基導入口和培養基送出口(未圖示)。圖示的下部結構體具有方形的底面,但下部結構體并不限于方形,也可以為例如圓形或楕圓形。
              蓋狀結構體44從多個上部結構體40的上方覆蓋多個上部結構體40和下部結構體43的開口部。蓋狀結構體44的基本結構、材料和功能如第三實施方式中說明所述。應予說明,蓋狀結構體44可以具備第三實施方式中例示的氣體交換機構(未圖示),也可以進一步具備氣體導入口和氣體排出口。
              具備這樣的框體42和下部結構體43具有下述優點:例如在如iPS細胞那樣目標干細胞的數目少的情形中,可以使用大量的組織細胞作為樣本,且可以用單一的下部結構體進行收集。
              根據第五實施方式,本發明是具備多個上部結構體、和由多個容器構成的下部結構體的膜分選培養器。圖5是示出本實施方式的膜分選培養器5的構成的概念圖。
              膜分選培養器5含有:多個上部結構體50、前述框體55、和下部結構體53,所述下部結構體53由多個容器構成,該多個容器分別單獨地保持使各個前述上部結構體50的分離膜浸漬于其中的流體。
              上部結構體50的基本結構和功能如第四實施方式中說明所述。本實施方式中,多個上部結構體50各自可以具備不同孔尺寸和/或孔密度的分離膜,或者可以全部相同。
              框體55的基本結構和功能如第四實施方式中說明所述,但本實施方式中,框體55的下部的保持機構553上設置有多個狹縫,以避免與下部結構體53的隔室532的干擾。
              另一方面,本實施方式的下部結構體53由與前述該多個上部結構體的各個對應的多個容器構成。具體地,下部結構體的主體由多個容器構成,該多個容器由被格子狀的隔室532所間隔形成的分隔構成。格子狀的隔室532可以與下部結構體53一體地形成,也可以是可裝卸于下部結構體53的構件,在使用時,以由隔室532形成的各容器間的物質無法連通的程度固定于下部結構體中。
              下部結構體53中可以裝載并容納框體55。裝載時,框體52的各孔551與下部結構體53的多個容器的每一個對應。另外,框體55的隔室552重合于下部結構體53的隔室532之上。進而,可以將多個上述結構體50的各個裝載于框體52的各孔551中。此時,下部結構體53的一個容器與一個上述結構體50的組合作為獨立的膜分選培養器發揮功能。所以,可以在被隔室532所間隔的容器中分別保持使上部結構體50的分離膜浸漬于其中的流體。例如,可以將含有不同的遷移因子和/或培養基的不同種類的流體加入分別的容器,進行膜分離。
              另外,本實施方式的膜分選培養器5還可以具備未圖示的蓋狀結構體。蓋狀結構體可以具備第三實施方式中例示的氣體交換機構(未圖示),也可以進一步具備氣體導入口和氣體排出口。圖示的下部結構體53不具有密封用的溝,可以與覆設的蓋狀結構體組合使用。
              通過使用第五實施方式的膜分選培養器5,例如,在對迄今為止沒有分選過的干細胞進行分選時,配置多種孔尺寸的上部結構體,配置多種含有各種細胞遷移因子的培養基并進行組合,由此具有可以一次性進行分選條件篩選的優點。
              根據第六實施方式,本發明是可以進行傳代培養的封閉體系膜分選培養器。圖22是示出本實施方式的膜分選培養器6的構成的概念圖。
              膜分選培養器6除了上部結構體60、下部結構體63之外,以皿66之外必須的構成。上部結構體60的基本結構、材料和功能如第一實施方式中說明所述。上部結構體60的開口部設置有從上部結構體60的上方覆蓋開口部的蓋狀結構體64。蓋狀結構體64具備導入口65。導入口65是貫穿蓋狀結構體64而設置的優選為有機硅制的管,將上部結構體60構成的容器內部和外部連通。導入口65主要用于在封閉體系中將切碎的牙髓組織或牙髓樣本細胞插入膜分選培養器6的內部而不受外界污染。在封閉體系中也可以由導入口65進行培養基更換。上部結構體60所具備的膜62的結構、材料和功能與上述第一實施方式相同。另一方面,本實施方式中的下部結構體63不存在與側面部一體地固定的底面部,而僅由側面部構成,除此之外,具有與第一實施方式相同的構成。
              皿66是由底面部和側面部構成的可進行細胞培養的容器。皿66設置有培養基的回收口661,可以在封閉體系中進行培養基更換、培養上清的回收或細胞回收,而不受外界污染。在皿66的底面部、且在朝向容器內側的表面,設置有未圖示的表面處理層。表面處理層具有細胞附著和擴增性優異的特性,并且優選為可以針對熱或光、或針對這兩者發生反應并分解。根據一個實施方式,表面處理層可以設計為針對特定波長的光照射發生反應、使構成表面處理層的物質發生分解。作為一例,可以形成使聚(N-異丙基丙烯酰胺)接枝聚合于皿66的底面部且面向容器內側的表面而成的表面處理層。該表面處理層在37℃保持疏水性,但通過將溫度降至30℃左右則發生相變而改變為親水性,由此可以使附著于層表面的細胞剝離。根據其它實施方式,表面處理層可以設計為針對特定的溫度變化發生反應,使構成表面處理層的物質發生分解。作為一例,可以形成含有膠原而成的表面處理層。此時,通過將溫度上升至膠原的改性溫度,表面處理層發生分解,可以使附著于層表面的細胞剝離。
              皿66的上部進一步具備從皿66的上方覆蓋皿66的開口部的蓋狀結構體67。蓋狀結構體67構成為將皿66的內部密閉,且即使上部結構體60和下部結構體63的層疊體沿垂直方向移動也會保持密閉狀態。
              本實施方式中,下部結構體63設置為能夠在皿66的內部沿垂直方向移動來使用。圖22(a)是示出進行膜分選時的設置方式的概念圖。此時,膜62、下部結構體63的側面部、和皿66的底面部構成封閉的空間,將從上部結構體60遷移的細胞保持于空間的內部。皿66的直徑優選為下部結構體63的直徑的約7~10倍。應予說明,圖6中為了明確地表示各構件而改變比例尺進行了記載。
              下部結構體63可以在垂直方向向上移動,并固定。為了培養基的更換或干細胞的回收而使下部結構體63移動時的膜分選培養器6的概念圖示于圖22(b)。此時,蓋狀結構體67也可以將皿66密閉。
              接著,從封閉體系培養方法的觀點說明第六實施方式的膜分選培養器6。封閉體系培養方法包括:進行膜分選的步驟、使干細胞增殖的步驟、將干細胞傳代的步驟、以及擴增并回收干細胞的步驟。進行膜分選的步驟中,按照第一實施方式中說明的方法進行干細胞的膜分選。該步驟中,從上部結構體60遷移至下部結構體63的細胞附著于被下部結構體63的側壁部圍住的皿66的底面。接著,在使干細胞增殖的步驟中,使上部結構體60和下部結構體的層疊體在垂直方向向上移動,通過培養基的回收口661更換為含10%血清的DMEM等增殖培養基,將遷移因子除去,使上部結構體60和下部結構體的層疊體在垂直方向向下移動,與66的底面部接觸并固定,由此使干細胞增殖。進而,實施將干細胞傳代的步驟。此時,使上部結構體60和下部結構體的層疊體在垂直方向向上移動、并固定。接著,通過對表面處理層賦予光或賦予熱、或者降低溫度,而使表面層分解,使增殖的干細胞剝離。此時,下部結構體63的側壁部和皿66的底面部沒有接觸,因而干細胞擴散于整個皿66中。接著,在擴增并回收干細胞的步驟中,經由培養基的回收口661,可以回收傳代干細胞。此時,可以將離心管與回收口661連接,在封閉體系中進行離心分離,從而回收細胞或培養上清。另外,各步驟中,培養基更換可經由培養基的回收口661進行。
              本實施方式中,通過在皿66設置表面處理層,可以不必將以往通常用于從培養容器剝離細胞的胰蛋白酶等酶用于細胞剝離。該細胞培養上清和細胞由于不含酶,因而可不進行離心洗滌而直接用于移植。
              根據第七實施方式,本發明為膜分選培養試劑盒。膜分選培養試劑盒含有膜分選培養器和細胞遷移因子。作為膜分選培養器,可使用上述第一實施方式至第六實施方式中的膜分選培養器1~6中的任一者、或其變形形式。
              細胞遷移因子優選為選自下述中的至少任一者:SDF-1、G-CSF、bFGF、TGF-β、NGF、PDGF、BDNF、GDNF、EGF、VEGF、SCF、MMP3、Slit、GM-CSF、LIF、HGF、S1P、原兒茶酸、和血清。另外,前述細胞遷移因子的濃度優選為1ng/ml~500ng/ml。這是為了高效地使干細胞遷移。即,這是因為若過于稀薄則有時會沒有遷移效果,若過濃則有時為發生分化。細胞遷移因子可以添加于培養基中使用。所以,本實施方式的試劑盒還可以含有培養基。此時,培養基可以使用Dulbecco's改良Eagle培養基、EBM2等,但并不限定于此。
              特別優選本實施方式的試劑盒含有作為細胞遷移因子的、優選為50~150ng/ml的濃度的G-CSF或bFGF作為試劑盒的構成構件。另外,除了細胞遷移因子之外,作為添加于培養基中的成分,還可以含有人自體血清或胎牛血清作為試劑盒的構成構件。這些血清構成為以相對于培養基的體積為5~20vol%的濃度進行添加。試劑盒可以按照第一實施方式至第五實施方式中的裝置和方法的說明進行制造、使用。
              根據本實施方式的膜分選培養試劑盒,可以使用用于膜分選培養器和分選的細胞遷移因子,更加快速地實施第一實施方式所詳述的干細胞分選方法。
              根據第八實施方式,本發明為分離膜。
              本實施方式的分離膜具備基材膜和功能層,所述基材膜由疏水性聚合物構成,所述功能層是選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上的親水性聚合物通過共價鍵鍵合于前述基材膜的表面而成的功能層,構成前述功能層的親水性聚合物的重量是前述分離膜總重量的1.5重量%至35重量%。
              由于有可能使膜的孔閉塞或因水系培養液而發生溶出,因有機溶劑殘存而對細胞造成不良影響,因而本發明中優選進行利用共價鍵合法的膜表面修飾。即,可以將為所期望的孔徑且以高開孔率開口的基材膜浸漬于添加有乙烯基吡咯烷酮系聚合物、和/或乙二醇系聚合物、和/或乙烯醇系聚合物、以及根據需要的醇的處理水溶液中后,照射高能射線,由此進行基材膜的表面修飾。
              形成本發明的分離膜的基材膜的聚合物適宜使用疏水性聚合物。本發明中,疏水性聚合物是指相對于20℃的水100g的溶解度小于0.001g的聚合物。具體地,疏水性聚合物可以是選自砜系聚合物、酰胺系聚合物、碳酸酯系聚合物、酯系聚合物、氨基甲酸酯系聚合物、烯烴系聚合物和酰亞胺系聚合物中的聚合物,但并不限定于此。其中,根據這些構成基材膜的疏水性聚合物的吸水率改變表面改性條件,由此可以更有效地賦予蛋白質和細胞的附著抑制性。
              基材膜只要是用于分離2個區域的膜,則不需要開有孔。例如,為了透過物質,可以使用如透析膜那樣開有40至80nm的孔的膜,為了分離細胞,可以使用開有1至10μm的孔的膜等,根據使用目的來選擇孔徑。特別地,本發明的分離膜可以適宜地用于利用細胞的趨化性的分離,此時3~8μm的孔徑容易使用。
              構成這些基材膜的聚合物一般疏水性強,具有大量附著蛋白質和細胞等的傾向。特別是由于活化的蛋白質或血小板、附著性細胞容易附著于膜表面,因而得到的結論是需要均勻地實施一定量以上的表面改性、即親水性聚合物的共價鍵合。
              乙烯基吡咯烷酮系聚合物是指選自聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮?乙酸乙烯酯共聚物、乙烯基吡咯烷酮?乙烯醇共聚物、乙烯基吡咯烷酮?苯乙烯共聚物、乙烯基吡咯烷酮?二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯共聚物和它們的改性聚合物中的聚合物,乙二醇系聚合物也包括側鏈含酯基的那些。乙烯醇系聚合物可根據皂化度而獲得各種種類,并無限定。本發明中將這些聚合物表述為親水性聚合物。其中,這些用于膜表面修飾的親水性聚合物優選為水溶性。因此,例如,可以使用數均分子量為1萬至100萬的聚合物,但只要為水溶性則并不限于上述分子量。
              本發明中,水溶性的聚合物是指相對于2 0 ℃的水1 0 0 g 的溶解度為1 g 以上、優選1 0 g 以上的聚合物。從蛋白質、血小板或附著性細胞等的附著抑制的觀點出發,優選本發明的分離膜含有這種水溶性聚合物。表面的適度的親水性和疏水性的平衡被認為對于蛋白質或血小板的附著抑制是重要的。實際上,已知親水性更強的水溶性聚合物存在的情形中,蛋白質、血小板或附著性細胞等的附著抑制效果進一步提高。
              分離膜中所含有的水溶性聚合物的量是分離膜總重量的優選1.5重量%以上、更優選5重量%。另外,含量即使過多效果也不改變,因而優選為40重量%以下、更優選為35 重量%。
              進而,親水性聚合物只要是具有水溶性單元和酯基單元的共聚物,則可在1個分子中獲得適度的親水性和疏水性的平衡,因而適宜。因此,作為共聚物,與接枝共聚物相比,更適宜使用嵌段共聚物或交替共聚物、無規共聚物。其原因認為是接枝聚合物中,主鏈上接枝的單元部分與蛋白質等接觸的機會大,因而相比于作為共聚物的特性,接枝鏈部分的特性的影響更大。另外,相比于嵌段共聚物,更優選交替共聚物、無規共聚物。認為這是因為嵌段共聚物中,各個單元的特性明確區別。從1個分子中的親水性和疏水性的平衡的方面出發,適宜使用具有選自無規共聚物和交替共聚物中的至少一者的共聚物。含酯基的聚合物中的酯基單元的摩爾比優選為0.3以上且0.7以下。酯基單元的摩爾比若小于0.3,則酯基的附著抑制效果降低。另外,若超過0.7,則水溶性單元的效果降低。
              作為存在于分離膜表面的表面改性聚合物的親水性聚合物的存在量可通過,例如,元素分析或核磁共振(NMR)測定、ESCA和全反射紅外分光法(以下有時記為ATR)的組合來得到。這是因為,ESCA測定表面的直至約10nm深度的方法,ATR是表面測定,是測定直至數μm深度的組成的方法。列舉聚砜分離膜為例子時,若將膜中的任意位置的親水性聚合物的存在量相對于聚砜單元的存在量之比作為單元量比,則只要ESCA中所得的單元量比的值比ATR中所得的值大30%以上,則可以使本發明中所述的膜表面的含酯基的聚合物的存在量比膜內部大30%以上。應予說明,各測定的值是3點的平均值。
              接著,從成形體的表面改性方法的觀點出發,對本實施方式進行說明。成形體的表面改性方法具備:將由疏水性聚合物構成的成形體浸漬于含有10~2000ppm的選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上親水性聚合物、且含有根據需要的0.01~0.2重量%的醇的處理水溶液中的浸漬步驟;和對由浸漬步驟得到的成形體照射高能射線,將成形體表面改性為蛋白附著抑制性、細胞附著抑制性的改性步驟。該成形體的表面改性方法在成形體為特定基材膜的情形中,也可以說是上述說明的分離膜的制造方法。該方法由于簡便且少量即可實施,因而是適宜的方法。
              這里所說的由疏水性聚合物構成的成形體并不限于膜,只要是具有特定形狀的成形體即可。在使用膜的情形中,可以是在上述分離膜的構成中作為基材膜進行說明的膜,此時,成形體的表面改性方法成為分離膜的制造方法。
              處理水溶液是用于浸漬由疏水性聚合物構成的成形體的水溶液。處理水溶液中,優選以總濃度計為10~5000ppm、更優選為10~2000ppm的方式含有選自乙烯基吡咯烷酮系聚合物、聚乙二醇系聚合物和乙烯醇系聚合物中的1種以上的親水性聚合物。應予說明,具體的濃度有時根據親水性聚合物的種類而不同。親水性聚合物溶液的濃度若低,則有時無法充分涂布由疏水性聚合物構成的成形體。另外,若濃度過高,例如在成形體為膜時,則將孔閉塞、或溶出物增多、或引起分離膜性能降低的情況多。應予說明,通過如后所述添加醇,可進一步有效地進行表面改性,因而可將濃度設定更低。
              另外,為了有效地進行表面修飾,優選根據由疏水性聚合物構成的成形體的原材料的吸水率改變處理水溶液的組成。這里,本發明中,由疏水性聚合物構成的成形體的吸水率是指,將成形體的原材料制為30~100μm膜厚的膜時,用純水洗滌后,將進行了干燥的膜在23℃的水中浸漬24小時,測定該過程中的重量增加率。該重量增加率為吸水率。另外,成形體為分離膜時,若為200μm以下的膜厚,則可以直接用純水洗滌后干燥,在23℃的水中浸漬24小時,可以由該過程中的重量增加率算出。
              由疏水性聚合物構成的成形體的吸水率為2%以下時,優選在該處理水溶液中進一步添加醇。這是因為,通過使醇共存,可以將由疏水性聚合物構成的成形體的表面均勻地被覆。制為添加的醇,若考慮殘留時的安全性,則優選為乙醇,但并不限定于此。例如,也可以使用甘油之類的多元醇。添加的醇的濃度優選為處理水溶液總重量的1重量%以下,為了安全則為0.5重量%以下,進一步優選為0.1重量%以下。通過預先使用醇提高吸附效率,可以有效地進行表面改性,即使是使用更低濃度的親水性聚合物也可以實現相同程度的表面改性。即,可以減少親水性聚合物的使用量,對于降低生產時的成本有效。
              另一方面,由疏水性聚合物構成的成形體的吸水率超過2%時,不必向處理水溶液中加入醇。
              在進行浸漬的步驟中,可以將整個成形體浸漬于處理水溶液中,也可以僅將欲進行表面改性的成形體的一部分浸漬于處理水溶液中。
              作為改性步驟中使用的高能射線,可以使用UV、電子射線、γ射線、X射線。電子射線或γ射線由于容易提高反應率,因而更優選。另外,從殘留毒性少或簡便性的觀點出發,優選使用γ射線或電子射線。照射的射線量優選為5~35kGy,特別是將培養裝置整體用例如相當于被視為滅菌射線量的25kGy的射線量進行照射,由此還可以同時實施表面修飾和滅菌。然而,照射射線量若為100kGy以上,則生產率變差,發生聚合物的分解等,故不優選。
              應予說明,已知在照射高能射線時,若存在氧,則會產生氧自由基等,使得由疏水性聚合物構成的成形體分解。所以,理想的是照射放射射線時的成形體周圍的氧濃度為10體積%以下。
              第八實施方式的分離膜具有高的附著抑制性,因而可適宜地用作水處理用分離膜或機體成分分離膜。另外,本實施方式的改性方法不僅可適用于膜,也可適用于各種成形體,可以容易地以高效率實施表面改性。該表面改性方法尤其適于血液凈化用組件。這里,血液凈化用組件是指具有使血液循環至體外并將血中的廢物和有害物質除去的功能的組件,有人工腎臟或外毒素吸附柱等。
              以下,通過實施例更具體地說明本發明,但本發明并不受以下實施例的任何限定。
              實施例 1
              [利用TaxiScan比較對牙髓干細胞的遷移有效的遷移因子]
              實時水平趨化性分析使用了狗第4代的牙髓干細胞CD31-SP細胞。TAXIScan-FL(Effector Cell Institute,東京)在開有6μm的孔的有機硅和玻璃板之間形成針對細胞的大小進行了最優化(8μm)的通道,在通道內的一端注入細胞(105細胞/ml)1μl。將10ng/μl的各種遷移因子各1μl加入相反側,以形成恒定濃度梯度。根據遷移的視頻圖像,每30分鐘測量一次遷移細胞數直至4小時。圖6(a)示出了遷移因子導致的遷移能力差異的時間歷程。對于BDNF,牙髓干細胞非常迅速地遷移,在2小時達到穩定(plateau)。對于SDF-1和bFGF,遷移也較快地進行。對于GDNF、VEGF、MMP3、G-CSF,遷移細胞均是緩慢增加,在4小時后,除了PDGF、GM-CSF之外,達到基本相同的遷移細胞數。
              [由TaxiScan得到的對牙髓干細胞的遷移有效的遷移因子的濃度]
              在TAXIScan-FL的微通道中注入105細胞/ml的狗第4代的牙髓干細胞CD31-SP細胞1μl,在相反側將G-CSF以濃度0、0.1、1、5、10、20、40、100ng/μl各加入1μl,根據遷移的視頻圖像,每30分鐘測量一次遷移細胞數直至1個半小時。圖6(b)示出了G-CSF的濃度差異導致的遷移能力的差異的時間歷程。10ng/μl的情形中,遷移細胞數最多,隨后以5、40、20、100、1、0.1ng/μl的順序確認到遷移細胞數的減少。
              [由TaxiScan得到的對牙髓干細胞的遷移有效的血清的濃度]
              在TAXIScan-FL的微通道注入105細胞/ml的人的牙髓干細胞1μl,在相反側以濃度為0、5、10、15、20%各加入人血清1μl,根據遷移的視頻圖像,每3小時測量一次遷移細胞數直至24小時。進而,對使用人血清10%和20%、以及100ng/ml的GCSF和SDF-1的情形中的遷移能力進行比較。圖7(a)示出了血清的濃度差異導致的遷移能力的差異的時間歷程。20%的情形中,遷移細胞數最多,隨后,以15、10、5%的順序確認到遷移細胞數的減少。圖7(b)示出了G-CSF、SDF-1所致的遷移能力的時間歷程。G-CSF、SDF-1與20%血清相比,遷移細胞數更多。
              [牙髓干細胞的分選]
              組裝由底面安裝有包被為細胞非粘附性的插入式細胞培養皿的PET膜(2×105孔/cm2、孔尺寸為3μm)的、底面直徑6.4mm、開口部直徑11.0mm、高度17.5mm的PET制的上部結構體與底面直徑15.0mm、開口部直徑15.0mm、高度22.0mm的聚苯乙烯制的下部結構體構成的膜分選培養器。為了對膜部分賦予細胞附著抑制性,將PET膜表面預先浸漬于在聚乙烯基吡咯烷酮-聚乙酸乙烯酯共聚物(乙烯基吡咯烷酮/ 乙酸乙烯酯(6/4)共聚物(BASF社制、“Kollidon VA64“))1000ppm 水溶液中添加0.1%乙醇而成的水溶液中,進行密封,然后照射γ射線25kGy進行修飾,制成分離膜。在該上部結構體的膜上部接種1×105細胞/250μl的狗新鮮初代牙髓細胞,在下部結構體中于含10%狗血清的Dulbecco's改良Eagle培養基(DMEM)中加入G-CSF或SDF-1以使最終濃度為100ng/ml。6小時后更換培養基,除去G-CSF,進而在含10%狗血清的DMEM中進行培養。圖8(a)、(b)和(c)中示出了發生遷移、附著、進而增殖的牙髓干細胞的相差顯微鏡圖像。在所有遷移因子的情形中,均確認到星狀且具有突起的細胞附著,并與用流式細胞儀分選CD31-SP細胞、CD105+細胞或CXCR4+細胞的情形相同地發生增殖。
              [分選的牙髓干細胞的特征化]
              將在膜分選培養器中使用G-CSF和SDF-1進行膜分選得到的上述牙髓干細胞傳代3代后,是細胞以1×106細胞/ml分散于含2%血清的DMEM中,使用各種干細胞表面抗原標志物的抗體(CD29、CD31、CD34、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146、CD150、CXCR4)在4℃下標記30分鐘后,進行流式細胞儀法。即,使用小鼠IgG1陰性對照(AbD Serotec Ltd.)、小鼠IgG1陰性對照(fluorescein isothiocyanate, FITC) (MCA928F)(AbD Serotec)、小鼠IgG1陰性對照(Phycoerythrin-Cy5、PE-Cy5)(MCA928C)(AbD Serotec),小鼠IgG1陰性對照(Alexa 647)(MRC OX-34)(AbD Serotec)、針對下述的抗體:CD29(PE-Cy5)(MEM-101A)(eBioscience)、CD31(FITC)(Qbend10)(Dako)、CD34(Allophycocyanin,APC)(1H6)(R&D Systems,Inc.)、CD44(Phycoerythrin-Cy7,PE-Cy7)(IM7)(eBioscience),CD73(APC)(AD2)(BioLegend),CD90(FITC)(YKIX337.217)(AbD Serotec)、anti-human CD105(PE) (43A3) (BioLegend)CD146(FITC)(sc-18837)(Santa Cruz,Biotech,Santa Cruz,CA,USA),CD150(FITC)(A12)(AbD Serotec)、CXCR4(FITC)(12G5)(R&D),在4℃下標記90分鐘。作為對照,使用了用流式細胞儀分選得到的狗牙髓CD105+細胞。
              表1是示出用上述膜分選培養器分選培養得到的牙髓干細胞的第3代通過流式細胞儀分析的干細胞的表面抗原的表達的表。與狗牙髓CD105+細胞相同地,用膜分選培養器分選得到的細胞在使用G-CSF時,CD105陽性率為95.1%,在使用SDF-1時為89.5%。另外,對于CD29、CD44、CD73、CD90,兩種級分中均為95%以上,因而可認為含有大量干細胞?前體細胞。另外,對于CXCR4,與用流式細胞儀分選得到的狗牙髓CD105+細胞相比為一半,進而,CD31、CD146大致為陰性。
              [表1]

              接著,使用Trizol(Invitrogen),從利用了G-CSF的膜分選牙髓干細胞的第3代分離總RNA,通過ReverTra Ace-α(Toyobo)合成第一鏈cDNA,用Light Cycler-Fast Start DNA master SYBR Green I(Roche Diagnostics)標記后,通過Light Cycler(Roche Diagnostics),以95℃10秒,62℃15秒,72℃8秒的程序進行干細胞標志物(CXCR4,Sox2,Stat3,Bmi1)的實時RT-PCR。進而,作為血管生成誘導因子(angiogenesis-inducing factor)和神經營養因子,使用了基質金屬蛋白酶(MMP)-3、VEGF-A,粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、NGF、BDNF。作為對照,使用牙髓CD105+細胞和未分選的牙髓樣本細胞,用β-肌動蛋白標準化。
              表2示出了干細胞標志物、血管生成誘導因子和神經營養因子的實時RT-PCR分析中使用的引物。
              [表2]

              表3示出使用G-CSF的膜分選狗牙髓干細胞和牙髓CD105+細胞的第3代的實時RT-PCR分析的干細胞標志物、血管生成誘導因子和神經營養因子的mRNA的與牙髓樣本細胞進行比較時的值。血管生成誘導因子?神經營養因子的VEGF、GDNF顯示出大致相同的表達量,對于GM-CSF、MMP3,膜分選細胞高達10倍以上,對于BDNF和NGF,CD105陽性細胞中觀察到高表達。對于干細胞標志物CXCR4和Bmi1,膜分選細胞非常高,Stat3表達大致相同,對于Sox2,膜分選細胞稍低。
              [表3]

              [體外的多能性]
              第三代至第五代中,進行牙髓膜分選細胞向血管、神經的分化誘導。結果示于圖9。如圖9(a)所示,膜分選牙髓干細胞顯示出向血管內皮細胞分化的能力。另外,如圖9(b)所示,膜分選牙髓干細胞顯示出神經球形成。
              實施例 2
              [膜分選牙髓干細胞的拔髓后根管內自體移植引起的牙髓再生]
              建立將狗(Narc,Chiba,Japan)根尖完全形成的恒牙除去全部牙髓,移植細胞級分以使牙髓再生的實驗模型。用戊巴比妥鈉(Schering-Plough,Germany)進行全麻后,將上顎第二切牙和下顎第三切牙的牙髓完全除去,使用#70K-file(MANI.INC,Tochigi,Japan)將根尖部擴大至0.7mm。向根尖側移植實施例2中進行膜分選得到的牙髓干細胞,向牙冠側移植G-CSF。即,將5×105個第四代的膜分選牙髓干細胞與膠原TE(新田ゼラチン,Osaka,Japan)一起進行DiI標記后,自體移植到根管內的下部。在根管上部進一步移植膠原TE和最終濃度15ng/μl的G-CSF。窩洞用磷酸鋅粘固劑(Elite Cement,GC,Tokyo,Japan)和粘合材料(Clearfil Mega Bond,Kuraray)處理后,用復合樹脂(Clearfil FII,Kuraray,Kurashiki,Japan)修復。作為對照,使用了牙髓CD105陽性細胞。14天后制作標本。為了進行形態分析,用4%多聚甲醛(PFA)(Nakarai Tesque,Kyoto,Japan)在4℃固定一晩,用10%甲酸脫鈣后,包埋于石蠟(Sigma)中。將石蠟切片(厚度5μm)用蘇木精-曙紅(HE)染色,進行形態學觀察。
              圖10(a)是示出G-CSF和膜分選牙髓干細胞自體移植引起的牙髓再生的圖。圖10(b)是圖10(a)中的用四邊形圍住的區域(b)的放大圖。圖10(c)是圖10(a)中的用四邊形圍住的區域C的放大圖。如圖10(a)、圖10(b)和圖10(c)所示,將膜分選牙髓干細胞與G-CSF一起移植時,牙髓樣組織直至14天才形成。如圖10(b)所示,再生組織中的細胞為紡錘形或星狀,與正常牙髓組織的細胞(圖10(d))類似。如圖10(c)所示,成牙本質細胞樣細胞附著于根管的牙本質壁,并向小管內伸出突起。
              實施例 3
              [膜分選人牙髓干細胞]
              使用膜分選培養器(1×105孔/cm2、孔尺寸為8μm),將1×105細胞/100μl的人新鮮初代牙髓細胞接種于膜上部。在膜下部結構體中,僅加入10%人血清,或者于含10%人血清的DMEM中加入10ng/ml或100ng/ml的G-CSF。22小時后更換培養基,除去G-CSF并進一步在含10%人血清的DMEM中進行培養。圖11中示出發生遷移、附著、進而增殖的牙髓干細胞的相差顯微鏡圖像。如圖12(a)、(b)、(c)所示,10%人血清、G-CSF10ng/ml和100ng/ml的任一情形中,均確認到星狀且具有突起的細胞附著,并與用流式細胞儀分選CD31-SP細胞、CD105+細胞或CXCR4+細胞的情形相同地發生增殖(圖12(d)、(e))。
              實施例 4
              [膜分選組織干細胞]
              使用本發明的膜分選培養器(1×105孔/cm2、孔尺寸為8μm),將1×105細胞/100μl的豬牙髓細胞、骨髄細胞、脂肪細胞接種于膜上部,在膜下部結構體中于含10%胎牛血清的DMEM中加入G-CSF 100ng/ml,22小時后更換培養基,除去G-CSF,并進一步在含10%胎牛血清的DMEM中進行培養。如圖13(a)、(b)、(c)所示,對于牙髓、骨髄、脂肪,均確認到星狀且具有突起的細胞附著,如圖13(d)所示,確認到與用流式細胞儀分選CD31-SP細胞、CD105+細胞的情形相同地發生增殖。
              實施例 5
              [1. 利用TAXIScan比較對牙髓干細胞的遷移有效的遷移因子]
              使用未分選的人牙髓細胞,利用TAXIScan-FL (Effector Cell Institute, 東京)進行實時水平趨化性分析。在開有6μm的孔的有機硅和玻璃板之間形成針對細胞的大小進行了最優化(8μm)的通道,在通道內的一端注入細胞(105 細胞/ml)1 μl。將10ng/μl的各種遷移因子(BDNF, GDNF,NGF,PDGF,G-CSF,SDF-1,bFGF,VEGF,LIF和GM-CSF)各1 μl加入相反側,以形成恒定濃度梯度。根據遷移的視頻圖像,每3分鐘測量一次遷移細胞數直至15小時。進而,使用G-CSF和bFGF作為遷移因子,研究添加了10%胎牛血清時的遷移能力的變化。
              使用各種遷移因子時的遷移能力的測定結果示于圖14。各種遷移因子導致的遷移能力的差異隨時間歷程觀察時,則在BDNF,GDNF,NGF,PDGF,G-CSF的情形中觀察到大量遷移細胞。在SDF-1,bFGF,LIF的情形中,觀察到較多遷移細胞。在GM-CSF情形中則沒怎么觀察到遷移。因此,以后對可以容易獲得滿足臨床使用基準(藥品和準藥品的制造管理和品質管理的基準相關的部令:GMP)的藥劑、在日本已獲藥事批準的作為遷移因子的G-CSF和bFGF進行了比較研究。
              G-CSF和bFGF所致的遷移能力的測定結果示于圖15。添加G-CSF和bFGF時,與僅10%血清的情形相比,遷移能力更高,若對G-CSF和bFGF各自進一步添加10%血清則遷移得到促進。其中,確認到G-CSF與bFGF相比更加促進遷移。由其結果可知,膜遷移分選中,向G-CSF添加10%血清來進行是有效的。
              如上所述,對于干細胞標志物的表達,用G-CSF 10ng/ml分選得到的膜分選細胞與用流式細胞儀分選得到的CD105+細胞相比,是類似的干細胞標志物表達率。用G-CSF 100ng/ml分選得到的膜分選細胞與CD105+細胞相比,CXCR4、G-CSFR表達率高,因而暗示含有更多的干細胞。另外,以G-CSF100ng/ml得到的膜分選細胞與CD105+細胞相比,具有更高的細胞增殖能力、遷移能力。進而,對于血管新生因子、神經營養因子的mRNA表達,也得知用G-CSF 100ng/ml進行分選時顯示出最高的表達。發明人已經報道了牙髓CD105+細胞的血管誘導能力、神經誘導能力高、牙髓再生能力高,通過本實驗的結果,暗示了用G-CSF 100ng/ml分選得到的膜分選細胞也與CD105+細胞相同地對于牙髓?牙本質再生有用。
              [2. 使用膜分選器的牙髓干細胞分選用的接種細胞數]
              作為膜分選器,可將作為上部結構的插入式細胞培養皿(聚碳酸酯基材膜(Polycarbonate Membrane)Transwell(注冊商標) Inserts、2×105孔/cm2、孔尺寸 8 μm、底面的直徑6.4 mm、開口部的直徑11.0 mm、高度17.5 mm) (Corning)插入作為下部結構的24 孔板(直徑15.0 mm、開口部的直徑15.0 mm、高度22.0 mm) (Falcon)來使用。其中,為了對聚碳酸酯基材膜賦予細胞非粘附性,將膜浸漬于在聚乙烯基吡咯烷酮-聚乙酸乙烯酯共聚物(乙烯基吡咯烷酮/ 乙酸乙烯酯( 6 / 4 ) 共聚物( B A S F 社制、“Kollidon V A 6 4 “ )) 1000ppm 水溶液添加0.1%乙醇而成的水溶液中,進行密封,然后照射γ射線25kGy進行修飾,制成分離膜。聚乙烯基吡咯烷酮-聚乙酸乙烯酯共聚物共價鍵合于基材膜表面,聚合物自身的安全性高,同時使用的乙醇也通過γ射線照射而被分解而低濃度化等,因而該表面修飾的安全性高。在該分離膜上部接種第2代人牙髓細胞2×104細胞/100μl、1×105細胞/100μl,在下部結構體的24孔中于含10%人血清的Dulbecco's改良Eagle培養基 (DMEM) 中以最終濃度為100 ng/ml加入G-CSF,48小時后除去G-CSF,將培養基更換為含10%人血清的DMEM,在相差顯微鏡下測定附著于24 孔下部的細胞數。
              其結果是,分選細胞率在2×104細胞/100μl下為5 %、在1×105細胞/100μl下為1 %。該結果暗示了細胞的分選效率根據細胞數而不同。
              [3. 使用膜分選器的牙髓干細胞分選用的遷移因子作用時間]
              在膜分選器的分離膜上部接種第2代人牙髓細胞2×104細胞/100μl,在下部結構體的24孔中于含10%人血清的DMEM中以最終濃度為100 ng/ml加入G-CSF,在相差顯微鏡下測定12、24、48小時、72小時后附著于24 孔下部的細胞數。
              使G-CSF作用時間為12、24、48、72小時的各情形中測定的附著細胞數的結果是,12小時后分選細胞率為0.3%、24小時后為1.7%、48小時后為5%、72小時后為5%。
              [4. 使用膜分選器的牙髓干細胞分選用的G-CSF濃度]
              在膜分選器的分離膜上部接種第2代人牙髓細胞 2×104 細胞/100μl,在下部結構體的24 孔中于含10%人血清的Dulbecco's改良Eagle培養基 (DMEM) 中以最終濃度為0, 10, 100, 500 ng/ml加入G-CSF。48小時后除去G-CSF,將培養基更換為含10%人血清的DMEM,在相差顯微鏡下測定附著于24 孔下部的細胞數。進一步培養,在70 %匯合后傳代。
              將使用各種濃度的G-CSF進行膜分選得到的上述牙髓干細胞傳代6代后,使用流式細胞儀測定干細胞表面抗原標志物表達率。即,將細胞以1×106 細胞/ml分散于含2%血清的DMEM中,用干細胞標志物抗體在4℃下標記30分鐘后,進行流式細胞儀法。即,使用小鼠IgG1陰性對照 (AbD Serotec Ltd.)、倉鼠IgG (PE-cy7) (eBio299Arm) (eBioscience)、大鼠IgG2b (PE-cy7) (RTK4530) (Biolegend)、小鼠IgG1 (APC) (NOPC-21) (Biolegend)、小鼠IgG1 (RPE) (SFL928PE) (AbD Serotec)、小鼠IgG1 (Alexa647) (F8-11-13) (AbD Serotec)、小鼠IgG2a (FITC) (S43.10) (MACS)、小鼠IgG1 (FITC) (MOPC-21) (Biolegend)、針對下述的抗體:CD29 (Phycoerythrin, PE-cy7) (eBio299Arm) (eBioscience)、CD31 (PE) (WM59) (BD Pharmingen)、CD44 (PE-cy7) (IM7) (eBioscience)、CD73 (APC) (AD2) (Biolegend)、CD90 (Alexa647) (F15-42-1) (AbD Serotec)、CD105 (PE) (43A3) (Biolegend)、CD146 (Alexa647) (OJ79c) (AbD Serotec)、CXCR4 (FITC) (12G5) (R&D Systems)、G-CSFR (CD114) (FITC) (38660),在4℃下標記90分鐘。作為對照,使用了用流式細胞儀分選得到的人牙髓CD105+細胞和未分選的人牙髓樣本細胞。
              接著,使用Trizol (Invitrogen),從利用了各種濃度的G-CSF的膜分選細胞的第6代分離總RNA,通過ReverTra Ace-α TOYOBO)合成第一鏈cDNA,用Light Cycler-Fast Start DNA master SYBR Green I (Roche Diagnostics)進行標記后,通過Light Cycler (Roche Diagnostics),以95℃10秒、65℃15秒、72℃8秒的程序進行血管生成誘導因子、神經營養因子的實時RT-PCR。作為血管生成誘導因子和神經營養因子,使用了粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、基質金屬蛋白酶(MMP)-3、VEGF-A、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、神經營養素-3 (NT-3)的引物 (表4)。作為對照,使用牙髓CD105+細胞和未分選的人牙髓樣本細胞,用β-肌動蛋白標準化。
              [表4]

              進而,在體外按照常規方法,進行第7代的牙髓膜分選細胞向血管、神經、脂肪、牙本質?骨的分化誘導。另外,對用各種G-CSF濃度分選得到的人膜分選細胞的通過人10%血清或G-CSF 100 ng/ml刺激所致的細胞增殖能力、和通過10 %人血清和G-CSF 100 ng/ml所致的細胞遷移能力進行比較。
              在相差顯微鏡圖像中觀察在板中附著進而增殖的牙髓干細胞。對于第6代未分選的人牙髓樣本細胞、第6代人牙髓CD105+細胞、僅用10%血清進行膜分選并培養7天后的膜分選細胞、以G-CSF 10 ng/ml+10%血清進行膜分選并培養7天后的膜分選細胞、以G-CSF 100 ng/ml+10%血清進行膜分選并培養7天后的膜分選細胞、以G-CSF 500 ng/ml+10%血清進行膜分選并培養7天后的膜分選細胞,得到了相差顯微鏡圖像。使用10 %人血清、G-CSF 0, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 500 ng/ml各濃度的情形中均觀察到為星狀且具有突起的細胞的附著、增殖。測定附著細胞數時,G-CSF 100 ng/ml中的分選細胞率為5%,接著500 ng/ml為4%、10 ng/ml為3%、0 ng/ml為2%。
              接著,將通過流式細胞儀進行的干細胞表面標志物的解析示于表5。通過流式細胞儀比較干細胞標志物表達率,結果CD29、CD44、CD73、CD90大致為陽性且未觀察到差異。CD105在未分選人牙髓樣本細胞中為19%,與之相對,在G-CSF 10 ng/ml和100 ng/ml中,與對照的CD105+細胞同樣地為90%以上。另外,以G-CSF 500 ng/ml和0 ng/ml進行膜分選得到的細胞中,CD105表達率分別為67%和58%。CXCR4在未分選人牙髓樣本細胞中為4.5%,在CD105+細胞中為8%,在以G-CSF 0 ng/ml進行膜分選得到的細胞中為5%,是低表達率。與之相對,在以G-CSF 100 ng/ml進行膜分選得到的細胞中為最高、為15%,在以G-CSF 10 ng/ml、500 ng/ml進行膜分選得到的細胞中也為10%以上。另一方面,對于作為G-CSF受體的G-CSFR,觀察到相對于CD105+細胞18%,G-CSF 100 ng/ml的情形中為最高、為76%,G-CSF 500 ng/ml、10 ng/ml的情形中依次減少。以上暗示了,CD105、CXCR4和G-CSFR的陽性率最高的以G-CSF 100 ng/ml進行膜分選得到的細胞可能含有最多的干細胞?前體細胞。
              [表5]

              使用以G-CSF 100 ng/ml得到的膜分選細胞來研究多能性。通過相差顯微鏡畫像來考察由G-CSF濃度(100 ng/ml)分選得到的膜分選細胞的血管誘導能力、神經誘導能力。膜分選細胞中,與CD105+細胞相同地,在基質凝膠上在6小時后觀察到索狀結構,顯示出向血管內皮細胞分化的能力。未分選人牙髓樣本細胞中,長時間觀察也未觀察到索狀結構形成。未分選的人牙髓樣本細胞中雖然基本未確認到,但在用G-CSF 100 ng/ml得到的膜分選細胞中,在誘導14天與CD105+細胞同樣地觀察到神經球形成。通過光學顯微鏡圖像來考察由G-CSF濃度(100 ng/ml)分選得到的膜分選細胞的脂肪誘導能力。脂肪誘導在全部細胞級分中均觀察到,脂肪標志物mRNA的表達量較未分選的人牙髓樣本細胞高。通過光學顯微鏡圖像考察由非常適宜的G-CSF濃度(100 ng/ml)分選得到的膜分選細胞的骨?牙本質誘導能力。骨?牙本質誘導也在所有細胞級分中被觀察到。對于骨?牙本質標志物mRNA表達量,與未分選的人牙髓樣本細胞相比,膜分選細胞中的表達量低。
              通過實時RT-PCR對血管生成誘導因子和神經營養因子的mRNA表達進行解析,結果示于表6。
              [表6]

              對于血管生成誘導因子?神經營養因子的GM-CSF、MMP3,與未分選的人牙髓樣本細胞相比,任意濃度的膜分選細胞中均顯示出10倍以上高的表達量,對于VEGF、BDNF、GDNF、NGF和NT-3,顯示出與CD105+細胞大致相同或者為2倍(以G-CSF 100 ng/ml得到的膜分選細胞中)的表達量,與未分選的人牙髓樣本細胞相比,觀察到高表達。對于干細胞標志物,Sox2在膜分選細胞中的表達量為10倍以上高,對于Oct4、Nanog、Rex1,是與CD105+細胞大致相同或2倍(以G-CSF 100 ng/ml得到的膜分選細胞中)的表達量。
              人血清所致的細胞增殖能力的比較(*p<0.05)的圖示于圖16。相對于血清的增殖能力在所有細胞級分中均未觀察到顯著性差異。G-CSF (100ng/ml)所致的細胞增殖能力的比較(**p<0.01, *p<0.05 : vs 未分選人牙髓樣本細胞、##p<0.01 : vs 牙髓CD105+細胞)示于圖17。對于相對于G-CSF的增殖能力,以G-CSF 100 ng/ml、500 ng/ml得到的膜分選細胞為最高,未分選的人牙髓樣本細胞和CD105+細胞相比觀察到了顯著性差異。相對于濃度的不同的G-CSF的細胞遷移能力的比較(**p<0.01, *p<0.05 : vs 未分選人牙髓樣本細胞、##p<0.01, #p<0.05 : vs 牙髓CD105+細胞)示于圖18。對于G-CSF所致的遷移能力,以G-CSF 100 ng/ml得到的膜分選細胞為最高,未分選的人牙髓樣本細胞和CD105+細胞相比觀察到了顯著性差異。
              [5.使用小鼠下肢缺血模型的體內血管新生能力]
              制作小鼠下肢缺血模型,向缺血部位移植未分選的人牙髓樣本細胞、以G-CSF100 ng/ml得到的膜分選細胞、CD105+細胞,14天后對血流量進行激光多普勒解析,對于血管新生,制作冷凍切片,利用BS-1 凝集素染色進行免疫組織學解析。
              激光多普勒解析的結果為:樣本細胞的移植中基本未確認到血流量的改善,而通過移植膜分選細胞則與移植CD105+細胞時相同地確認到顯著的血流量改善。另外,制作冷凍切片進行BS-1 凝集素染色時,通過膜分選細胞的移植確認到與CD105+細胞的移植時相同的血管新生。
              [6. 使用SCID小鼠的體內牙髓再生能力]
              將拔出的人牙切開后,將一端用粘固劑封閉,將未分選的人牙髓樣本細胞、以G-CSF100 ng/ml得到的膜分選細胞、CD105+細胞作為骨架(Scaffold)與膠原一同注入,移植到SCID小鼠的皮下,3周后比較牙髓再生能力。形態通過HE染色進行解析,神經再生能力和血管新生能力各自通過PGP9.5、BS1 凝集素染色、Ki67染色進行免疫組織學解析。對于移植細胞的局部化,通過針對人特異性基因Alu的原位雜交來進行解析。進而,將再生牙髓組織中的牙髓特異性標志物mRNA表達與正常牙髓組織進行比較。
              HE染色的結果中,通過人膜分選細胞的移植確認到與CD105+細胞移植時同樣地形成牙髓樣組織。另一方面,未分選的樣本細胞的移植中,少量的牙髓樣組織形成。另外,BS1 凝集素、PGP9.5染色的結果中,通過膜分選細胞的移植,與CD105+細胞移植時相同地確認到血管新生、神經再生。另外,基本為觀察到移植細胞的增殖,Alu的原位雜交的結果中,明確了形成了再生牙髓樣組織的是宿主的小鼠細胞。
              再生牙髓樣組織為牙髓的事實通過mRNA表達水平來考察,結果示于表7。
              [表7]

              牙髓特異性標志物TRH-DE、據報道牙髓中表達高的黏結蛋白聚糖、生腱蛋白 C的表達與正常牙髓相同,未確認到牙根膜、脂肪組織、骨?牙本質標志物mRNA的表達。由此明確了通過膜分選細胞的移植確認到的再生牙髓樣組織是牙髓。
              實施例 6
              [牙髓、骨髄、脂肪干細胞膜分選方法]
              [1. 使用膜分選器的牙髓、骨髄、脂肪干細胞分選]
              研究了是否可以通過膜分選方法與牙髓細胞同樣地從骨髄、脂肪細胞中分選干細胞。作為膜分選器,將作為上部結構的插入式細胞培養皿(聚碳酸酯基材膜(Polycarbonate Membrane)Transwell(注冊商標)Inserts、2×105孔/cm2、孔尺寸8 μm、底面的直徑6.4 mm、開口部的直徑11.0 mm、高度17.5 mm) (Corning)插入作為下部結構的24 孔板(直徑15.0 mm、開口部的直徑15.0 mm、高度22.0 mm) (Falcon)來使用。對聚碳酸酯基材膜進行表面包被處理以使細胞不粘附。為了對聚碳酸酯基材賦予細胞非粘附性,預先進行將聚碳酸酯基材膜浸漬于在聚乙烯基吡咯烷酮-聚乙酸乙烯酯共聚物(乙烯基吡咯烷酮/ 乙酸乙烯酯( 6 / 4 ) 共聚物( B A S F 社制、“Kollidon V A 6 4 “ )) 1000ppm 水溶液添加0.1%乙醇而成的處理水溶液中,進行密封,然后照射γ射線25kGy進行修飾的表面包被處理,制成分離膜。在該分離膜上部接種豬第2代牙髓、骨髄、脂肪細胞 1.5×104細胞/100 μl,在下部結構體的24 孔中于含10%FBS的Dulbecco's改良Eagle培養基 (DMEM) 中以最終濃度為100 ng/ml加入G-CSF,24小時后除去G-CSF,將培養基更換為含10%FBS的DMEM并進行培養,70 %匯合后進行傳代。
              結果得知,在與牙髓干細胞分選時相同的條件下,在骨髄、脂肪細胞中也在分離膜下部分選到細胞。
              [2. 干細胞表面抗原標志物陽性率的測定]
              將豬牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞傳代5代后,使用流式細胞儀對干細胞表面抗原標志物陽性率進行測定。將細胞以1×106 細胞/ml分散于含2%FBS的PBS中,用干細胞標志物抗體在4℃下標記60分鐘后,進行流式細胞儀法。具體地,使用小鼠IgG1陰性對照 (AbD Serotec Ltd.)、倉鼠IgG (PE-cy7) (eBio299Arm) (eBioscience)、大鼠IgG2b (PE-cy7) (RTK4530) (Biolegend)、小鼠IgG1 (APC) (NOPC-21) (Biolegend)、小鼠IgG1 (RPE) (SFL928PE) (AbD Serotec)、小鼠IgG1 (Alexa647) (F8-11-13) (AbD Serotec)、小鼠IgG2a (FITC) (S43.10) (MACS)、小鼠IgG1 (FITC) (MOPC-21) (Biolegend)、針對下述的抗體:CD29 (Phycoerythrin, PE-cy7) (eBioHMb1-1) (eBioscience)、CD31 (PE) (LCI-4) (AbD Serotec)、CD44 (PE-cy7) (IM7) (eBioscience)、CD73 (APC) (AD2) (Biolegend)、CD90 (Alexa647) (F15-42-1) (AbD Serotec)、CD105 (FITC) (MEM-229) (Abcam)、CXCR4 (FITC) (12G5) (R&D Systems)、G-CSFR (CD114) (Alexa 488) (S1390) (Abcam)在4℃下標記60分鐘。標記后,加入以終濃度0.01M添加有Hepes、以終濃度2%添加如FBS的Hank’s緩沖液,進行流式細胞儀法。作為陰性對照,使用了未分選的牙髓、骨髄、脂肪樣本細胞。
              通過流式細胞儀對干細胞標志物表達率進行比較,結果示于表8。
              [表8]

              CD29、CD44、CD73、CD90大致為陽性,且在膜分選細胞和未分選的樣本細胞之間未確認到差異。對于CD105,對未分選樣本細胞來說,在牙髓、骨髄、脂肪細胞中分別為14.7 %、22.3 %、25.9 %,與之相對,對膜分選細胞來說,分別為70.8 %、73.2 %、61.7 %,與未分選樣本細胞相比,陽性率均高。另外,對于CXCR4,對未分選樣本細胞來說,在牙髓、骨髄、脂肪中為5.9 %、4.1 %、2.8 %,與之相對,對膜分選細胞來說,為14.1 %、14.2 %、7.0 %,陽性率高。進而,對于作為G-CSF受體的G-CSFR,就未分選樣本細胞而言為23.7 %、21.9 %、23.6 %,與之相對,就膜分選細胞而言為74.2 %、48.5 %、49.5 %,陽性率高。由以上可知,通過膜分選方法,可以從骨髄、脂肪細胞中與牙髓細胞同樣地分選CD105、CXCR4和G-CSFR的陽性率高的干細胞?前體細胞。
              [3. 血管新生因子、神經營養因子、干細胞標志物mRNA表達的解析]
              接著,通過實時 RT-PCR對血管新生因子、神經營養因子、干細胞標志物mRNA表達進行解析。使用Trizol (Invitrogen),從傳代5代的牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞以及各自的未分選樣本細胞中提取總RNA,DNase (Roche) 處理后,通過ReverTra Ace-α(TOYOBO)合成第一鏈cDNA,用Light Cycler-Fast Start DNA master SYBR Green I (Roche Diagnostics)標記后,通過Light Cycler (Roche Diagnostics),以95℃10秒、65℃或60℃15秒、72℃8秒的程序進行血管新生因子、神經營養因子、干細胞標志物的實時RT-PCR。作為血管新生因子和神經營養因子、干細胞標志物使用的引物示于表9。粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管內皮生長因子(VEGF)-A、基質金屬蛋白酶(MMP)-3、趨化因子(C-X-C motif)受體(CXCR)-4、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)、神經生長因子(NGF)、nanog同源框 (Nanog)、SRY (性別決定區 Y)-box 2 (Sox2)、轉錄的信號傳導物和激活物(STAT)-3、端粒酶反轉錄酶 (Tert)、Bmi1多梳環指癌基因(polycomb ring finger oncogene)(Bmi-1) 的引物用β-肌動蛋白標準化。
              [表9]

              對血管生成誘導因子和神經營養因子的mRNA表達進行解析,結果示于表10。膜分選細胞與未分選的樣本細胞相比,GM-CSF、MMP3、BDNF的表達量為約5~10倍高,對于VEGF、GDNF、NGF,與CD105+細胞顯示出大致相同或2倍(以G-CSF 100 ng/ml得到的膜分選細胞中)的表達量,與未分選的牙髓樣本細胞相比,觀察到高表達。
              [表10]

              [4. 血管誘導能力、細胞增殖能力、細胞遷移能力的解析]
              在體外對第5代的牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞的血管誘導能力、細胞增殖能力、細胞遷移能力進行考察。對于血管誘導能力,將分散于EGM-2 (Lonza) 培養基中的細胞在基質凝膠上進行三維培養,比較管腔形成能力。對于細胞增殖能力,使用TetraColor One (生化學バイオビジネス),對10%FBS或G-CSF 100 ng/ml刺激所致的細胞增殖能力進行測定。另外,相對于G-CSF的細胞遷移能力通過TAXIScan-FL進行實時水平趨化性分析。即,在開有6 μm的孔的有機硅和玻璃板之間,形成針對細胞的大小進行了最優化(8 μm)的通道,在通道內的一端注入豬牙髓、骨髄、脂肪膜分選細胞、未分選的各種樣本細胞 (105細胞/mlを1 μl)。將10 ng/μl的各種遷移因子各1 μl加入相反側,以形成恒定濃度梯度。根據遷移的視頻圖像,每3分鐘測量一次遷移細胞數直至24小時。
              對于血管誘導,膜分選細胞中,來源于牙髓、骨髄、脂肪的均在基質凝膠上于5小時后觀察到索狀結構,顯示出向血管內皮細胞分化的能力。另一方面,未分選樣本細胞中,長時間觀察也未觀察到索狀結構形成。
              顯示胎牛血清所致的細胞增殖能力的圖示于圖19,顯示G-CSF所致的細胞增殖能力的圖示于圖20。對于任一膜分選細胞,FBS、G-CSF所致的細胞增殖能力均比未分選的樣本細胞高。測定G-CSF所致的細胞遷移數的圖示于圖21。對于G-CSF所致的細胞遷移能力,可知與任一未分選樣本細胞相比,膜分選細胞的遷移能力均最高。
              實施例 7
              [直接從牙髓和脂肪新鮮組織分選干細胞的膜分選法]
              對是否能夠不進行酶消化而直接通過膜分選法,與細胞同樣地從牙髓、脂肪組織分選干細胞進行了研究。作為膜分選器,將作為上部結構的插入式細胞培養皿(經表面修飾的聚碳酸酯基材膜Transwell(注冊商標) Inserts、2×105孔/cm2、孔尺寸8 μm、底面的直徑6.4 mm、開口部的直徑11.0 mm、高度17.5 mm) (Corning)插入作為下部結構的24 孔板(直徑15.0 mm、開口部的直徑15.0 mm、高度22.0 mm) (Falcon)來使用。應予說明,該聚碳酸酯基材膜也與上述實施例6同樣地事先進行細胞非附著性的處理,制備分離膜,并組裝于膜分選裝置中。將切碎的狗新鮮牙髓組織或脂肪組織靜置在該聚碳酸酯膜上部,在下部結構體的24 孔中于含10%FBS的Dulbecco's改良Eagle培養基 (DMEM) 中以最終濃度為100 ng/ml加入G-CSF,24小時后除去G-CSF,將培養基更換為含10%FBS的DMEM并進行培養,70 %匯合后進行傳代。
              24小時后遷移并附著的牙髓干細胞和脂肪干細胞示于圖23。結果得知,在與從樣本細胞分選時相同的條件下,對于牙髓組織和脂肪組織也在膜下部分選到細胞。
              實施例 8
              接著,列舉本發明的分離膜的實施例和比較例,對本發明進行說明,但本發明并不受這些例子所限定。
              [1.測定方法]
              (1)X射線光電子能譜法(ESCA)測定
              對分離膜的內表面和外表面各進行3點測定。測定樣品用超純水漂洗后,在室溫、0.5托下干燥10小時,然后供測定。作為測定裝置、條件,如下所述。  
              測定裝置: ESCLAB220iXL
              激發X射線: 單色AlKa1,2射線(1486.6eV)
              X射線直徑: 0.15mm
              光電子逸出角度:90°(檢測器相對于試樣表面的斜率)。
              另外,用元素分析法對本發明的分離膜進行分析,由此可以由例如氮量(a(原子數%))和硫量(b(原子數%))的值等算出分離膜表面的親水性聚合物的量。應予說明,聚丙烯腈的情形中,將2200cm-1附近的來源于腈基的C ≡ N的峰的強度( A C N )與A C O之比與上述相同地進行,對膜制作校準曲線,求出內部的乙酸乙烯酯單元量比。
              ( 2 ) 紅外吸收光譜的親水性聚合物分布的測定方法
              將分離膜用超純水漂洗后,在室溫、0.5托下干燥10小時。通過J A S C O 社制I R T - 3 0 0 0的顯微A T R 法,對該干燥分離膜的表面進行測定。測定中,將視野范圍(光圈)設為100μ m × 100μm,積分次數設為1點30次,將光圈每次移動3μm,以縱橫各5點的總計25 點進行測定。另外,根據與未進行表面改性的膜的差光譜的測定,計算親水性聚合物的附著量。
              (3)膜的人血小板附著試驗方法
              在切成圓筒狀的Falcon( 注冊商標)管(18 mmΦ 、N o.2051)上安裝分離膜,以使要評價的面朝向圓筒內部,用石蠟將間隙包埋。將該圓筒管內用生理食鹽液洗滌后,用生理食鹽液充滿。采集健康志愿者的靜脈血后,立即添加肝素達到50 U/ml。將前述圓筒管內的生理食鹽液棄去后,將前述血液在采血后10分鐘以內加入圓筒管內1.0 ml,在37 ℃振蕩1小時。然后,將中空絲膜用10 ml的生理食鹽液洗滌,用2.5重量%戊二醛生理食鹽液進行血液成分的固定,用20 ml的蒸餾水進行洗滌。將洗滌的分離膜在常溫0.5托下減壓干燥10小時。將該分離膜用雙面膠帶粘貼于掃描型電子顯微鏡的試樣臺上。然后,通過濺射在中空絲膜表面形成Pt-Pd的薄膜,作為試樣。將該分離膜的內表面通過場發射型掃描型電子顯微鏡( 日立社制S800),以倍率1500倍對試樣的內表面進行觀察,對1個視野中(4.3 × 103 μm2)的附著血小板數進行計數。將中空絲長度方向上的中央附近的10個不同視野中的附著血小板數的平均值作為血小板附著數(個/ 4.3 × 103 μm2)。
              作為血小板附著抑制性良好的材料,血小板附著數為40(個/4.3 × 103 μm2)以下,進而為20(個/4.3×103μm2)以下,優選為10(個/4.3×103μm2)以下。
              (4)細胞透過性評價
              使用在BD社制插入式細胞培養皿上粘貼了本發明分離膜的皿,間充質干細胞使用PromoCell公司的“ Mesenchymal Stem Cell”,分化培養培養基使用#C-28011 Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium, Ready-to-use(間充質干細胞增殖培養基),將該培養基加入改造BD社制插入式細胞培養皿下部,在上部加入上述細胞和培養用培養基(Mesenchymal Stem Cell Expansion Media, Human/Mouse, StemXVivo),進而在下部的培養基中以最終濃度為100 ng/ml加入G-CSF,在37℃的CO2孵育器中放置12小時。此時,從上部落到下部培養皿中的細胞數使用相差顯微鏡來測量。
              對于PET膜、聚碳酸酯膜、PP膜、聚砜膜、聚酰胺膜的吸水率,聚酰胺膜為4.2%、超過了2%,除此之外均為2%以下。應予說明,聚合物吸水率是將所用的基材膜在23℃在水中浸漬24小時,將重量增加量作為吸水率。
              按照吸水率,使用由聚碳酸酯構成的膜、和聚酰胺膜(“Nylon66”),根據下表所述的條件實施表面處理。用所用的膜適宜替換“插入式細胞培養皿”的膜的部分,對通過G-CSF遷移因子所致的細胞遷移而透過并附著于下部培養皿的細胞數進行計數。可知,使用由PET構成的膜的情形中,對于乙醇(EtOH)添加體系,細胞的附著性受到抑制,落下并附著于下部培養皿的細胞變多。同樣地,可知在聚酰胺膜中,未添加EtOH的體系中未表現出細胞附著抑制性。
              應予說明,親水性聚合物對表面的結合量通過元素分析法、ESCA、IR法而適宜分析求出。使用的親水性聚合物如下所述。
              PVP:聚乙烯基吡咯烷酮(K90,K30)東京化成品
              PVA:聚乙烯醇(可樂麗(クラレ)公司制)
              VA64:聚乙烯基吡咯烷酮/聚乙酸乙烯酯共聚物(BASF社制Kollidon VA64)。
              [聚碳酸酯膜的處理結果]
              使用利用了孔徑8μm的聚碳酸酯膜的插入式細胞培養皿,浸漬于各條件的水溶液中,進行密封,然后照射γ射線25kGy進行表面改性。在膜上部接著人間充質干細胞 1×104細胞/100μl,在相差顯微鏡下測定附著于24 孔下部的細胞數,評價分離性能。結果示于以下的表11。
              [表11]

              [聚酰胺膜的處理結果]
              將孔徑8μm的聚酰胺膜替換插入式細胞培養皿的膜部分,浸漬于各條件的水溶液,進行密封,然后照射γ射線25kGy進行表面改性。在膜上部接著人間充質干細胞 1×104細胞/100μl,在相差顯微鏡下測定附著于24 孔下部的細胞數,評價分離性能。結果示于以下的表12。
              [表12]

              [親水性聚合物的影響]
              使用利用了孔徑8μm的聚碳酸酯膜的插入式細胞培養皿,浸漬于各條件的水溶液中,進行密封,然后照射γ射線25kGy,進行表面改性。在膜上部接著人間充質干細胞 1×104細胞/100μl,在相差顯微鏡下測定附著于24 孔下部的細胞數,評價分離性能。結果示于以下的表13。
              [表13]

              [血小板附著性的確認]
              使用由PET構成的未開有孔的膜,在各條件下測量血小板附著數。結果示于以下的表14。
              [表14]

              [聚碳酸酯膜的處理結果]
              使用利用了孔徑5μm的聚碳酸酯膜的插入式細胞培養皿,浸漬于各條件的水溶液中,進行密封,然后照射γ射線25kGy進行表面改性。在膜上部接種第2代人牙髓細胞 2×104細胞/100μl,在下部結構體的24 孔中于含10%人血清的Dulbecco's改良Eagle培養基 (DMEM) 中以最終濃度為100 ng/ml加入G-CSF,48小時后除去G-CSF,將培養基更換為含10%人血清的DMEM,在相差顯微鏡下測定附著于24 孔下部的細胞數。結果示于表15。
              [表15]

              [聚酰胺膜的處理結果]
              接著,將孔徑5μm的聚酰胺膜替換插入式細胞培養皿的膜部分,浸漬于各條件的水溶液,進行密封,然后照射γ射線25kGy,進行表面改性。與上述相同地得到的結果示于表16。
              [表16]

              符號說明
              1、2、3、4,5         膜分選培養器
              10、20、30、40、50、60 上部結構體
              12、22、32、62       分離膜
              121、221           孔
              13、23、33、43、53、63 下部結構體
              231               培養基導入口
              232               培養基送出口
              24、34、44          蓋狀結構體
              241               氣體導入口
              242               氣體排出口
              331、431           彈性體
              35、335            保持機構
              45、55             框體
              451、551           孔
              452、552           隔室
              453、553           保持機構
              64                蓋狀結構體
              65                導入口
              66                皿
              67                蓋狀結構體
              661               培養基的回收口
              100               培養基
              200               樣本細胞
              300               培養基
              a                 惰性氣體
              b                 排出氣體
              c                 培養基
              d                 使用完的培養基
                                       序列表
               
              <110>  National Institute for Longevity Sciences
               
              <120>  膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的干細胞分選方法
               
              <130>  2204-PCT
               
              <150>  JP2011-075861
              <151>  2011-03-30
               
              <160>  76   
               
              <170>  PatentIn version 3.5
               
              <210>  1
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Sox2的狗正向引物
               
              <400>  1
              agctagtctc caagcgacga                                                   20
               
               
              <210>  2
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Sox2的狗反向引物
               
              <400>  2
              ccacgtttgc aactgtccta                                                   20
               
               
              <210>  3
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Bmi1的狗正向引物
               
              <400>  3
              cactcccgtt cagtctcctc                                                   20
               
               
              <210>  4
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Bmi1的狗反向引物
               
              <400>  4
              ccagatgaag ttgctgacga                                                   20
               
               
              <210>  5
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  CXCR4的狗正向引物
               
              <400>  5
              ctgtggcaaa ctggtacttc                                                   20
               
               
              <210>  6
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  CXCR4的狗反向引物
               
              <400>  6
              tcaacaggag ggcaggtatc                                                   20
               
               
              <210>  7
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Stat3的狗正向引物
               
              <400>  7
              gtggtgacgg agaagcaaca                                                   20
               
               
              <210>  8
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Stat3的狗反向引物
               
              <400>  8
              ttctgtctgg tcaccgactg                                                   20
               
               
              <210>  9
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GM-CSF的狗正向引物
               
              <400>  9
              gcagaacctg cttttcttgg                                                   20
               
               
              <210>  10
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GM-CSF的狗反向引物
               
              <400>  10
              ccctcagggt caaacacttc                                                   20
               
               
              <210>  11
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  MMP3的狗正向引物
               
              <400>  11
              ccctctgatt cctccaatga                                                   20
               
               
              <210>  12
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  MMP3的狗反向引物
               
              <400>  12
              ggatggccaa aatgaagaga                                                   20
               
               
              <210>  13
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  VEGF-A的狗正向引物
               
              <400>  13
              ctacctccac catgccaagt                                                   20
               
               
              <210>  14
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  VEGF-A的狗反向引物
               
              <400>  14
              acgcaggatg gcttgaagat                                                   20
               
               
              <210>  15
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  BDNF的狗正向引物
               
              <400>  15
              gttggccgac acttttgaac                                                   20
               
               
              <210>  16
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  BDNF的狗反向引物
               
              <400>  16
              cctcatcgac atgtttgcag                                                   20
               
               
              <210>  17
              <211>  19
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GDNF的狗正向引物
               
              <400>  17
              gccgagcagt gactcaaac                                                    19
               
               
              <210>  18
              <211>  19
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GDNF的狗反向引物
               
              <400>  18
              tctcgggtga ccttttcag                                                    19
               
               
              <210>  19
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  NGF的狗正向引物
               
              <400>  19
              caacaggact cacaggagca                                                   20
               
               
              <210>  20
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  NGF的狗反向引物
               
              <400>  20
              atgttcacct ctcccagcac                                                   20
               
               
              <210>  21
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  β-肌動蛋白的狗正向引物
               
              <400>  21
              aagtacccca ttgagcacgg                                                   20
               
               
              <210>  22
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  β-肌動蛋白的狗反向引物
               
              <400>  22
              atcacgatgc cagtggtgcg                                                   20
               
               
              <210>  23
              <211>  19
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Oct4的人正向引物
               
              <400>  23
              cagtgcccga aacccacac                                                    19
               
               
              <210>  24
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Oct4的人反向引物
               
              <400>  24
              ggagacccag cagcctcaaa                                                   20
               
               
              <210>  25
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Nanog的人正向引物
               
              <400>  25
              cagaaggcct cagcacctac                                                   20
               
               
              <210>  26
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Nanog的人反向引物
               
              <400>  26
              attgttccag gtctggttgc                                                   20
               
               
              <210>  27
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Sox2的人正向引物
               
              <400>  27
              aatgccttca tggtgtggtc                                                   20
               
               
              <210>  28
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Sox2的人反向引物
               
              <400>  28
              cggggccggt atttataatc                                                   20
               
               
              <210>  29
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Rex1的人正向引物
               
              <400>  29
              tggacacgtc tgtgctcttc                                                   20
               
               
              <210>  30
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Rex2的人反向引物
               
              <400>  30
              ctcgaacctt ccagatcacc                                                   20
               
               
              <210>  31
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Stat3的人正向引物
               
              <400>  31
              gtggtgacgg agaagcagca                                                   20
               
               
              <210>  32
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Stat3的人反向引物
               
              <400>  32
              ttctgcctgg tcactgactg                                                   20
               
               
              <210>  33
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  CXCR4的人正向引物
               
              <400>  33
              ccgtggcaaa ctggtacttt                                                   20
               
               
              <210>  34
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  CXCR4的人反向引物
               
              <400>  34
              tcagcaggag ggcagggatc                                                   20
               
               
              <210>  35
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GM-CSF的人正向引物
               
              <400>  35
              gcctggagct gtacaagcag                                                   20
               
               
              <210>  36
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GM-CSF的人反向引物
               
              <400>  36
              cagcagtcaa aggggatgac                                                   20
               
               
              <210>  37
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  MMP3的人正向引物
               
              <400>  37
              cctcaggaag cttgaacctg                                                   20
               
               
              <210>  38
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  MMP3的人反向引物
               
              <400>  38
              gggaaaccta gggtgtggat                                                   20
               
               
              <210>  39
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  VEGF-A的人正向引物
               
              <400>  39
              atggcagaag gagaccagaa                                                   20
               
               
              <210>  40
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  VEGF-A的人反向引物
               
              <400>  40
              atggcgatgt tgaactcctc                                                   20
               
               
              <210>  41
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  BDNF的人正向引物
               
              <400>  41
              aaacatccga ggacaaggtg                                                   20
               
               
              <210>  42
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  BDNF的人反向引物
               
              <400>  42
              cgtgtacaag tctgcgtcct                                                   20
               
               
              <210>  43
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GDNF的人正向引物
               
              <400>  43
              ccaacccaga gaattccaga                                                   20
               
               
              <210>  44
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GDNF的人反向引物
               
              <400>  44
              agccgctgca gtacctaaaa                                                   20
               
               
              <210>  45
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  NGF的人正向引物
               
              <400>  45
              atacaggcgg aaccacactc                                                   20
               
               
              <210>  46
              <211>  19
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  NGF的人反向引物
               
              <400>  46
              gcctggggtc cacagtaat                                                    19
               
               
              <210>  47
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  NT-3的人正向引物
               
              <400>  47
              agactcgctc aattccctca                                                   20
               
               
              <210>  48
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  NT-3的人反向引物
               
              <400>  48
              ggtgtccatt gcaatcactg                                                   20
               
               
              <210>  49
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  β-肌動蛋白的人正向引物
               
              <400>  49
              ggacttcgag caagagatgg                                                   20
               
               
              <210>  50
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  β-肌動蛋白的人反向引物
               
              <400>  50
              agcactgtgt tggcgtacag                                                   20
               
               
              <210>  51
              <211>  19
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Nanog的豬正向引物
               
              <400>  51
              ccccgaagca tccatttcc                                                    19
               
               
              <210>  52
              <211>  22
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Nanog的豬反向引物
               
              <400>  52
              cgagggtctc agcagatgac at                                                22
               
               
              <210>  53
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Sox2的豬正向引物
               
              <400>  53
              aatgccttca tggtgtggtc                                                   20
               
               
              <210>  54
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Sox2的豬反向引物
               
              <400>  54
              cggggccggt atttataatc                                                   20
               
               
              <210>  55
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Stat3的豬正向引物
               
              <400>  55
              gtggtgacag agaagcagca                                                   20
               
               
              <210>  56
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Stat3的豬反向引物
               
              <400>  56
              ttctgcctgg tcactgactg                                                   20
               
               
              <210>  57
              <211>  18
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Tert的豬正向引物
               
              <400>  57
              caggtgtacc gcctcctg                                                     18
               
               
              <210>  58
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Tert的豬反向引物
               
              <400>  58
              ccagatgcag tcttgcactt                                                   20
               
               
              <210>  59
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Bmi1的豬正向引物
               
              <400>  59
              atatttacgg tgcccagcag                                                   20
               
               
              <210>  60
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  Bmi1的豬反向引物
               
              <400>  60
              gaagtggccc attccttctc                                                   20
               
               
              <210>  61
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  CXCR4的豬正向引物
               
              <400>  61
              ccgtggcaaa ctggtacttt                                                   20
               
               
              <210>  62
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  CXCR4的豬反向引物
               
              <400>  62
              tcaacaggag ggcaggtatc                                                   20
               
               
              <210>  63
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GM-CSF的豬正向引物
               
              <400>  63
              gccctgagcc ttctaaacaa                                                   20
               
               
              <210>  64
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GM-CSF的豬反向引物
               
              <400>  64
              gtgctgctca tagtgcttgg                                                   20
               
               
              <210>  65
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  MMP3的豬正向引物
               
              <400>  65
              acccagatgt ggagttcctg                                                   20
               
               
              <210>  66
              <211>  21
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  MMP3的豬反向引物
               
              <400>  66
              ggagtcactt cctcccagat t                                                 21
               
               
              <210>  67
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  VEGF-A的豬正向引物
               
              <400>  67
              atggcagaag gagaccagaa                                                   20
               
               
              <210>  68
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  VEGF-A的豬反向引物
               
              <400>  68
              atggcgatgt tgaactcctc                                                   20
               
               
              <210>  69
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  BDNF的豬正向引物
               
              <400>  69
              ttcaagaggc ctgacatcgt                                                   20
               
               
              <210>  70
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  BDNF的豬反向引物
               
              <400>  70
              agaagaggag gctccaaagg                                                   20
               
               
              <210>  71
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GDNF的豬正向引物
               
              <400>  71
              acggccatac acctcaatgt                                                   20
               
               
              <210>  72
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  GDNF的豬反向引物
               
              <400>  72
              ccgtctgttt ttggacaggt                                                   20
               
               
              <210>  73
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  NGF的豬正向引物
               
              <400>  73
              tggtgttggg agaggtgaat                                                   20
               
               
              <210>  74
              <211>  19
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  NGF的豬反向引物
               
              <400>  74
              ccgtgtcgat tcggataaa                                                    19
               
               
              <210>  75
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  β-肌動蛋白的豬正向引物
               
              <400>  75
              ctcttccagc cctccttcct                                                   20
               
               
              <210>  76
              <211>  20
              <212>  DNA
              <213>  人工序列
               
              <220>
              <223>  β-肌動蛋白的豬反向引物
               
              <400>  76
              acgtcgcact tcatgatcga                                                   20

              關 鍵 詞:
              分選 培養 試劑盒 使用 干細胞 方法 以及 分離
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              本文標題:膜分選培養器、膜分選培養試劑盒、和使用其的干細胞分選方法、以及分離膜.pdf
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              展開
              大连码头渔歌酒楼

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