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              • 下載費用:20 金幣  

              具有高纖維素酶活性的菌株及其應用和獲得方法.pdf

              摘要
              申請專利號:

              CN201010105373.7

              申請日:

              2010.02.04

              公開號:

              CN101935621A

              公開日:

              2011.01.05

              當前法律狀態:

              終止

              有效性:

              無權

              法律詳情: 未繳年費專利權終止IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20100204授權公告日:20111123終止日期:20140204|||授權|||實質審查的生效IPC(主分類):C12N 1/20申請日:20100204|||公開
              IPC分類號: C12N1/20; C22B3/18; B01D53/84; B01D53/48; C02F11/02; C02F3/34; C12R1/01(2006.01)N 主分類號: C12N1/20
              申請人: 山東大學
              發明人: 林建群; 劉瑋; 林建強; 劉相梅; 顏望明
              地址: 250100 山東省濟南市歷城區山大南路27號
              優先權:
              專利代理機構: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219 代理人: 王緒銀
              PDF完整版下載: PDF下載
              法律狀態
              申請(專利)號:

              CN201010105373.7

              授權公告號:

              |||101935621B||||||

              法律狀態公告日:

              2015.04.01|||2011.11.23|||2011.03.02|||2011.01.05

              法律狀態類型:

              專利權的終止|||授權|||實質審查的生效|||公開

              摘要

              本發明公開了一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌,為高亞鐵氧化活性A.ferrooxidans?pTCYC1;其特征在于:該菌命名為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans),菌株已于2009年12月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏中心編號為:CGMCC?NO.3549。本發明的基因工程菌較野生型的氧化亞鐵硫桿菌在亞鐵氧化活性方面有一定的提高,且性能穩定,在生物浸出、煙氣脫硫、酸性礦井水的處理以及污泥中重金屬的去除等領域具有很大的應用前景。

              權利要求書

              1: 一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌, 為高亞鐵氧化活性 A.ferrooxidans pTCYC1 ; 其特征在于 : 該菌命名為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 (Acidithiobacillus ferrooxidans), 菌株 已于 2009 年 12 月 28 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心, 保藏中心 編號為 : CGMCC NO.3549。
              2: 權利要求 1 所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌在生物浸出、 煙氣脫硫、 酸性礦井 水的處理以及污泥中重金屬的去除中的應用。

              說明書


              一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌及其應用

                  技術領域 本發明涉及一株硫桿菌及其應用, 尤其涉及一株具有較高亞鐵氧化能力的基因工 程菌嗜酸氧化亞鐵硫桿菌及其構建與應用。
                   背景技術 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 (Acidithiobacillus ferrooxidans) 是在細菌浸礦過程中 起關鍵作用的菌種之一。嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在 Fe2+ 基質中生長時, Fe2+ 被快速氧化成 Fe3+ 提供電子進入細菌呼吸鏈, 而 Fe3+ 作為一種強氧化劑在生物浸礦等過程中起著關鍵的 作用。 因此, 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌氧化 Fe2+ 離子的能力是衡量其浸礦能力的一項重要指標。 經檢索目前還沒有任何關于以轉基因的方式來提高嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 Fe2+ 離子氧化能 力的報道。
                   發明內容 針對現有技術中對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 Fe2+ 離子氧化能力遺傳改良方法的空白, 本發明要解決的問題是通過轉基因的方法將氧化亞鐵電子傳遞鏈蛋白 CYC1 基因導入嗜酸 氧化亞鐵硫桿菌提供一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌以提高其氧化 Fe2+ 離子的能力, 使嗜酸氧化亞鐵硫桿菌更高效地發揮生物冶金的功能。
                   本發明所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌為高亞鐵氧化活性 A.ferrooxidanspTCYC1,該 菌 命 名 為 嗜 酸 氧 化 亞 鐵 硫 桿 菌 (Acidithiobacillus ferrooxidans), 菌株已于 2009 年 12 月 28 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心 ( 中國科學院微生物研究所, 中國北京 ), 保藏中心編號為 : CGMCC NO.3549。
                   本發明的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 (Acidithiobacillus ferrooxidans) 經鑒定, 具有 如下生物學特征 :
                   革蘭氏陰性, 有鞭毛, 好氧, 嗜酸, 為化能自養細菌, 短桿狀, 大小為 (0.3 ~ 0.5) μm×(1 ~ 2)μm ; 能夠以二價鐵、 元素硫或者還原態硫復合物作為能源, 在含有硫酸亞鐵 和硫代硫酸鈉的固體培養基上能生長 ; 菌落形態不規則, 凹陷, 邊緣呈鋸齒狀, 酒紅色, 不透 明; 生長最適溫度為 25-30℃, 生長最適 pH 為 1.5 ~ 2.5。
                   本發明所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的構建及在亞鐵培養基中的生長及 應用, 涉及的步驟順序如下 :
                   (1) 菌 種 選 擇 : 嗜 酸 氧 化 亞 鐵 硫 桿 菌 ATCC 19859(Acidithiobacillus ferrooxidansATCC19859) ; 大腸桿菌 DH5α(Escherica coli DH5α)。
                   (2) 氧化亞鐵電子傳遞鏈蛋白 CYC1 高效表達載體的構建 : CYC1 蛋白編碼基因克隆 自嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 ATCC19859 染色體 DNA, 所用引物為 :
                   上 游 引 物 cyc1EU(GTACGAATTCAGGAGCCGATGCCATGACGACATACTT),下 游 引 物 cyc1XD(CCTCTCTAGATTA CAACGATGAAAGATAAGCCGCCACA)。
                   上游引物引入 EcoR I 酶切位點, 下游引物引入 Xba I 酶切位點以及 6×His 標簽
                   以方便檢測 cyc1 基因在細胞內的表達情況。將擴增產物進行 EcoR I 和 Xba I 雙酶切, 回 收 744bp 大小的片段 ; 同時對可移動性的質粒載體 pJRD215 進行 EcoRI 和 XbaI 雙酶切, 回 收約 10kb 的載體片段 ; 用 T4 連接酶將這兩個片段連接, 以連接液轉化大腸桿菌 DH5α, 在 含有 100μg/ml 鏈霉素 (Sm) 的 LB 固體平板上 37℃靜置培養, 進行轉化子的篩選, 挑取轉化 子進行質粒提取、 酶切驗證, 構建出中間質粒 pCYC1。
                   以質粒 pMMB24DNA 為模板, 設計引物 Ptac-1(5’ -GTACAAGCTTATCGACTGCACGGTGCAC C-3’ ) 和 Ptac-2(5’ -GTACGAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG-3’ ) 擴增不含調控區域的 Tac 啟動 子, 命名為 Ptac。擴增產物經 HindIII 和 EcoR I 雙酶切, 連接至 pCYC1 質粒中 cyc1 基因上 游 HindIII-EcoR I 位點, 連接液轉化大腸桿菌 DH5α。在含有 Sm(100μg/ml) 的 LB 固體平 板上 37℃靜置培養, 進行轉化子的篩選, 挑取轉化子進行質粒提取、 酶切驗證, 同時對所插 入的外源基因 Ptac 以及 cyc1 基因進行測序驗證, 構建了可轉移質粒 pTCYC1。從經測序驗 證準確無誤的轉化子中提取質粒 pTCYC1, 轉化至含 RP4 質粒的大腸桿菌 DH5α, 命名為大腸 桿菌 DH5α(RP4/pTCYC1), 為下一步的接合轉移實驗作準備。
                   (3) 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的制備 : 以大腸桿菌 DH5α(RP4/pTCYC1) 作 為供體菌, 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 ATCC19859 作為受體菌在濾膜上進行接合轉移。供體菌和 受體菌分別離心收集菌體, 洗滌液洗滌至少三次, 用洗滌液分別懸浮供體菌和受體菌至相 同密度, 然后按一定比例混合后取適量的菌懸液 (0.1 ~ 0.3ml) 加到無菌硝酸纖維素濾膜 上, 濾膜置于接合平板上 30 ~ 35℃培養 24 ~ 72h, 使之接合。取濾膜用 1ml 無機鹽洗滌 液洗下菌體, 稀釋成一系列不同濃度 : 100、 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-7, 分別取 100μl 涂布含相應抗生素的 2 ∶ 2 選擇平板及相應的不含抗生素的對照平板。同時在選擇性平板 上分別涂布供體菌和受體菌作為對照。放置 25 ~ 30℃溫箱中培養 7 ~ 10d, 直至板上形成 明顯菌落。
                   (4) 接合子的種子培養 : 挑取步驟 (3) 中選擇性平板上形成的接合子菌落, 在無菌 條件下用接種環接于 30mL 9K-FeSO4 培養基 (Sm 300μg/ml) 中, 25-30℃條件下, 160rpm 震 蕩培養 3 ~ 5d, 制得種子液 ;
                   (5) 接 合 轉 移 子 擴 大 培 養 : 以 5 % 體 積 比 的 接 種 量, 將種子液接種于 200mL9K-FeSO4 培養基 (Sm 300μg/ml)) 中, 25-30℃條件下, 160rpm 振蕩培養 3 ~ 5d ;
                   (6) 接合轉移子的質粒提取驗證 : 將步驟 (5) 所得的培養液真空抽濾出去培養液 中的高鐵沉淀 ; 離心收集菌體, 用 9K 無機鹽溶液洗滌至少 3 次直至菌泥中沒有可見的高鐵 沉淀, 再用 PBS 緩沖液洗菌體 2 次, 然后按照常規的堿裂解法進行質粒抽提。
                   質粒提取驗證結果 : 陽性的接合子命名為 A.ferrooxidans pTCYC1 ;
                   (7)A.ferrooxidans pTCYC1 中 重 組 質 粒 所 攜 帶 cyc1 基 因 在 嗜 酸 氧 化 亞 鐵 硫 桿菌中的表達 : 將步驟 (5) 所得的培養液真空抽濾出去培養液中的高鐵沉淀 ; 離心收集 菌體, 用 9K 無機鹽溶液洗滌至少 3 次直至菌泥中沒有可見的高鐵沉淀, 收集足夠量的 A.ferrooxidans pTCYC1 菌體, 洗滌后重懸于裂解緩沖液, 超聲破碎細胞。 經 Bradford 法測 定樣品中的蛋白濃度后, 取等量蛋白與等體積的 2×Laemmli 緩沖液混合, 煮沸 5min 后進行 Western blotting 檢測, 驗證質粒 pTCYC1 上所攜帶 cyc1 基因是否能在嗜酸氧化亞鐵硫桿 菌中正常表達 ;
                   (8) 基因工程菌 A.ferrooxidans pTCYC1 亞鐵離子氧化活性測定 : 將步驟 (5) 所得的培養液真空抽濾出去培養液中的高鐵沉淀 ; 離心收集菌體, 用 TE 緩沖液洗菌體三次后 將重懸于 TE 緩沖液中。取細菌懸浮液加入反應緩沖液中, 30℃振蕩培養, 在培養的不同時 2+ 間取培養液以鄰菲啰啉法測定培養液中剩余 Fe 的濃度 ;
                   (9) 重組質粒 pTCYC1 在 A.ferrooxidans ATCC19859 的穩定性檢測 : 在固體平板 上挑取 A.ferrooxidans 陽性接合轉移子菌落一個, 接種到不含有篩選標記的 9K-FeSO4 液 體培養基中, 在沒有選擇壓力條件下 30℃振蕩培養 5d, 然后按照 1 ∶ 1000 的比例轉接, 如 此連續轉接 5 次 ( > 50 代 ), 稀釋后分別涂布含有抗生素的 2 ∶ 2 選擇平板以及不含抗生 素的 2 ∶ 2 固體平板, 25-35℃培養 10d。 通過計算抗生素抗性菌落占總菌落的比例, 測出重 組質粒在嗜酸氧化亞鐵硫桿菌中的穩定性。
                   其中, 步驟 (3) 中所述的菌體接合培養時間優選是 48h, 接合培養溫度優選 30℃ ; 固體培養溫度優選是 30℃, 培養時間是 7d ;
                   其中, 步驟 (4)、 (5) 中所述的菌體培養溫度優選是 30℃ ;
                   上 述 嗜 酸 氧 化 亞 鐵 硫 桿 菌 ATCC 19859(Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC19859) 購自美國標準生物品收藏中心 ; 大腸桿菌 DH5α(Escherica coli DH5α) 購自 原平皓 ( 天津 ) 生物技術有限公司。
                   上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的制備中, pJRD215 質粒構建見 Davison J, Heusterspreute M, Chevalier N, Ha-Thi V, Brunel F.Vectors with restriction site banks.V.pJRD215, a wide-host-range cosmid vector with multiple cloning sites.Gene.1987, 51(2-3) : 275-80 ; pMMB24 質粒構建見 Miroslawa M.Bagdasarian, Egon Amann, RudolfLurz, Beate Ruckert and Michael Bagdasarian.Activity of the hybrid trp-lac(tac)promoter ofEscherichia coli in Pseudomonas putida.Construction of broad-host-range, controlled-expression vectors, 1983, Gene, 26 : 273-282 ; RP4 質粒 構建見 Datta, N., R.W.Hedges, E.J.Shaw, R.B.Sykes and M.H.Richmond.Properties of an R factor fromPseudomonas aeruginosa, 1971, J.Bacteriol, 108 : 1244-1249。
                   上述質粒的構建中, 培養大腸桿菌 DH5α 使用的 LB 液體培養基, 配方為 :
                   每 1000ml 蒸餾水中添加 : 蛋白胨 10g, 酵母粉 5g, NaCl 10g, 用 2N NaOH 溶液調 pH 2 至 7.0 ~ 7.5, 15 磅 / 寸 高壓蒸汽滅菌 20min, 37℃培養。
                   上述 LB 固體培養基為上述 LB 液體培養基中加入 1.8%瓊脂粉, pH 7.0 ~ 7.5。
                   在上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌培養使用的液體 9K-FeSO4 無機鹽培養基, 配方為 :
                   每 1000ml 蒸餾水中添加 : (NH4)2SO43g, K2HPO40.5g, KCl 0.1g, MgSO4·7H2O 0.5g, Ca(NO3)20.01g, 用濃 H2SO4 調 pH 2.0, 121℃條件下滅菌 20min ; 配置 44.8%的 FeSO4.7H2O 濃 溶液, 過濾除菌, 使用前按按 1 ∶ 9 的比例與 9K 無機鹽培養液混合。
                   上述 2 ∶ 2 固體培養基配方為 :
                   A: 2g Na2S2O3·5H2O 溶解于 10ml 蒸餾水中 ;
                   B: 2g FeSO4.7H2O 溶解于 10mlpH 值預調為 2.0 的酸性水中 ;
                   C: 4.5g(NH4)2SO4, 0.15g KCl, 0.75g MgSO4·7H2O 溶解于 500ml 蒸餾水中 ;
                   D: 6g 瓊脂溶于 480ml 蒸餾水 ;
                   其中, 組分 A 與 B 過濾除菌, C 與 D 121℃條件下滅菌 20min, 待 C 與 D 組分冷卻至 45℃左右時, 將四種組分混合, 傾倒平板備用。上述 2 ∶ 2 接合培養基為上述 2 ∶ 2 固體培養基中加入 0.1%的酵母粉, pH 4.8 ~5.0。 其中, 步驟 (3) 中所述的菌體洗滌液為上述 2 ∶ 2 培養基 C 組分中加入等體積的 蒸餾水作為菌體洗滌液。
                   上述步驟 (6) 中的 PBS 緩沖液配方為 :
                   每 1000ml 蒸餾水中添加 : NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO41.44g, KH2PO40.24g, 用 HCl 2 調 pH 值至 7.4, 加 H2O 定容至 1L, 15 磅 /cm , 滅菌 20min。
                   上述步驟 (7) 中的裂解液配方為 :
                   每 1000 毫升蒸餾水各成分含量為 : 50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0), 150mmol/L NaCl, 100mg/L 苯甲基磺酰氟 (PMSF)。
                   上述步驟 (7) 中 2×Laemmli 緩沖液配方為 :
                   4% SDS, 29%甘油, 10% β- 巰基乙醇, 0.04%溴酚藍 ; 0.125M Tris-HCl ;
                   上述步驟 (8) 中的 TE 緩沖液配方為 : 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA。
                   本發明所述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌在生物浸出、 煙氣脫硫、 酸性礦井水 的處理以及污泥中重金屬的去除中的應用。
                   實驗證實 : 本 發 明 所 述 的 嗜 酸 氧 化 亞 鐵 硫 桿 菌 基 因 工 程 菌 (A.ferrooxidans pTCYC1) 與野生型嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 (A.ferrooxidans ATCC19859) 相比較, 其氧化亞鐵 離子的能力提高了 13%, 這對嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在生物浸出中的應用有著重要的意義。 此外, 因嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在除生物浸出以外其它方面的應用, 如煙氣脫硫、 酸性礦井水 的處理以及污泥中重金屬的去除等, 也是基于嗜酸氧化亞鐵硫桿菌氧化二價鐵離子的能 力, 因此該發明具有廣泛的應用前景。具體實施方式
                   實施例 1 : 重組質粒 pTCYC1 的構建及鑒定。
                   (1) 將含有 cyc1 基因以及 6×His 標簽編碼基因與穿梭性質粒 pJRD215 連接后, 轉 化大腸桿菌 DH5α, 在含有 Km 的 LB 固體平板篩選得到含有 Km 抗性質粒的大腸桿菌 DH5α, 經提取質粒酶切驗證, 轉化子中攜帶的質粒確實含有插入片段。
                   (2) 將 Ptac 基因片段與中間載體 pCYC1 連接后, 轉化大腸桿菌 DH5α, 在含有 Km 的 LB 固體平板篩選得到含有 Km 抗性質粒的大腸桿菌 DH5α, 經提取質粒酶切驗證, 轉化子 中攜帶的質粒確實含有插入片段。 將驗證過的陽性克隆進行測序, 選取測序正確的克隆, 提 取質粒, 轉化至大腸桿菌 DH5α(RP4) 在含有 Sm 的 LB 固體平板上篩選得到接合轉移所用的 供體菌大腸桿菌 DH5α(RP4/pTCYC1)。
                   上述 LB 篩選培養基中, 卡那霉素 (Km) 或鏈霉素 (Sm) 的篩選濃度為 100μg/ml。
                   實施例 2 : 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的構建及鑒定。
                   (1) 分別收集指數生長中期的大腸桿菌 DH5α(RP4/pTCYC1) 作為供體菌, 指數生 長中期的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 ATCC19859 作為受體菌, 無機鹽洗滌液洗滌 3 次, 按相同菌體 濃度懸浮于洗滌液中備用。
                   (2) 按供體菌與受體菌的體積比為 1 ∶ 1, 將懸浮液進行混合, 取 200μl 放于孔徑 為 0.45μm 的硝酸纖維素濾膜 ( 光面朝上 ) 上, 30℃于接合平板上培養 48h ; 1ml 洗滌液將濾膜上的菌體洗下, 稀釋為 10-1、 10-2、 10-3、 10-4, 分別取 100μl 涂布 2 ∶ 2 篩選平板, 30℃靜 置培養 10d。篩選平板中抗生素 Km 濃度為 200μg/ml。
                   (3) 挑取篩選平板上的抗性菌落, 接種于 30ml9K-FeSO4 培養基 (Km 300μg/ml) 中, 30℃條件下, 160rpm 震蕩培養 5d., 制得種子液 ; 以 5%體積比的接種量, 將種子液接種 于 200mL 9K-FeSO4 培養基 (Km 300μg/ml)) 中, 30℃條件下, 160rpm 震蕩培養 4d 后收集菌 液進行質粒提取驗證。
                   (4) 經質粒提取驗證, 從篩選平板上挑取的接合子能夠提取出分子量大小正確的 質粒, 而從作為對照的 A.ferrooxidans ATCC19859 中則未能提取出質粒。
                   結果表明, 重組質粒通過濾膜接合的方式成功地從大腸桿菌 DH5α(RP4/pTCYC1) 轉移至了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌 ATCC19859 中, 提示已成功獲得了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因 工程菌 A.ferrooxidans pTCYC1。
                   實施例 3 : 重組質粒 pTCYC1 所攜帶 cyc1 基因在嗜酸氧化亞鐵硫桿菌中的表達
                   (1) 菌種選擇 : A.ferrooxidans pTCYC1, A.ferrooxidans ATCC19859 ;
                   (2) 種子培養 : 將 A.ferrooxidans pTCYC 1 及 A.ferrooxidans ATCC19859 在無菌 條件下用接種環接一環于 30mL 9K-FeSO4 液體培養基中, 30℃條件下, 振蕩培養至穩定期, 制得種子液 ; (3) 擴 大 培 養 : 以 5 % 的 體 積 比 的 接 種 量, 將兩株菌的種子液接種于 200mL9K-FeSO4 液體培養基中, 30℃條件下, 振蕩培養至穩定期 ( 約 4d) ;
                   (4) 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌總蛋白 SDS-PAGE 電泳 : 將步驟 (3) 中得到的培養液抽濾 去除高鐵沉淀, 離心收集菌體, 將菌體重懸于裂解緩沖液中, 超聲破碎細胞, 待樣品中完整 細胞的數目不超過細胞總數的 10%時 ( 鏡檢確定 ), 停止超聲, 13000rpm 離心 10min 去除細 胞碎片。 Bradford 法測定 A.ferrooxidans pTCYC1 及 A.ferrooxidansATCC19859 樣品中蛋 白濃度后, 取相同量的蛋白以 15%的變性聚丙烯酰胺凝膠分離 ;
                   (5) 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌總蛋白的 Western-blotting 檢測 : 將步驟 (4) 中在聚丙 烯酰胺凝膠中得到有效分離的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌總蛋白轉印至 PVDF 膜上, 分別進行一 抗 (Anti-His Antibody) 及二抗 (Poly Rabbit Anti-mouse immunoglobulins/HRP) 孵育 后, 進行 ECL 發光檢測 ;
                   (6) 經 Western-blotting 檢測驗證, 質粒 pTCYC1 上所攜帶的 cyc1 基因在嗜酸氧 化亞鐵硫桿菌中得到了有效的表達。
                   實施例 4 : 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌基因工程菌的菌種鑒定及保藏信息。
                   本發明構建的高亞鐵氧化活性 A.ferrooxidans pTCYC1 菌株已于 2009 年 12 月 28 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 ( 中國科學院微生物研究所, 中 國北京 ), 保藏中心編號為 : CGMCC NO.3549。
                   上述嗜酸氧化亞鐵硫桿菌, 經鑒定, 具有如下生物學特征 :
                   革蘭氏陰性, 有鞭毛, 好氧, 嗜酸, 為化能自養細菌, 短桿狀, 大小為 (0.3 ~ 0.5) μm×(1 ~ 2)μm ; 能夠以二價鐵、 元素硫或者還原態硫復合物作為能源, 在含有硫酸亞鐵 和硫代硫酸鈉的固體培養基上能生長 ; 菌落形態不規則, 凹陷, 邊緣呈鋸齒狀, 酒紅色, 不透 明; 生長最適溫度為 25-30℃, 生長最適 pH 為 1.5 ~ 2.5。
                   實施例 5 : A.ferrooxidans pTCYC1 亞鐵離子氧化活性的測定
                   (1) 菌種選擇 : A.ferrooxidans pTCYC1, A.ferrooxidans ATCC19859 ;
                   (2) 種子培養 : 將 A.ferrooxidans pTCYC1 及 A.ferrooxidans ATCC19859 在無菌 條件下用接種環接一環于 30mL 9K-FeSO4 液體培養基中, 30℃條件下, 振蕩培養至穩定期, 制得種子液 ;
                   (3) 擴 大 培 養 : 以 5 % 的 體 積 比 的 接 種 量, 將兩株菌的種子液接種于 200mL9K-FeSO4 液體培養基中, 30℃條件下, 振蕩培養至穩定期 ( 約 4d) ;
                   (4) 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌亞鐵氧化活性的測定 : 將步驟 (3) 中得到的培養液抽濾 去除高鐵沉淀, 離心收集菌體, 用 TE 緩沖液懸浮至相同濃度, 取一定量的細胞懸液抽提細 胞總蛋白, 以 bradford 法進行蛋白定量。取相同體積懸浮接入 3ml 反應緩沖液中, 在反應 不同時間從反應體系中取出 0.2ml 反應液, 12000g 離心 2min 后, 確定反應液中剩余的 Fe2+ 濃度, 根據 Fe2+ 濃度的變化確定嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的亞鐵氧化酶活性 ;
                   (5) 本 實 驗 所 構 建 的 基 因 工 程 菌 A.ferrooxidans pTCYC1 較 野 生 型 A.ferrooxidansATCC19859, 亞鐵氧化能力得到了一定的提高 : 實驗所測得的基因工程菌 2+ A.ferrooxidansATCC19859 亞鐵氧化活性為 5.3μmol Fe oxidized/mg Protein/min, 而 2+ 基因工程菌亞鐵氧化活性為 6.0μmol Fe oxidized/mg Protein/min, 相對于野生型, 本實 驗所構建的基因工程菌亞鐵氧化活性提高了 13%。
                   上述 A.ferrooxidans pTCYC1 在進行種子培養及擴大培養時, 培養基中加入濃度 為 300μg/ml 的卡那霉素 (Km)。8

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              具有 纖維素酶 活性 菌株 及其 應用 獲得 方法
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