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              • 下載費用:20 金幣  

              基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法.pdf

              摘要
              申請專利號:

              CN201510116739.3

              申請日:

              2015.03.18

              公開號:

              CN104694653A

              公開日:

              2015.06.10

              當前法律狀態:

              實審

              有效性:

              審中

              法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):C12Q 1/68申請日:20150318|||公開
              IPC分類號: C12Q1/68; C12N15/10; C02F9/08; C02F1/32 主分類號: C12Q1/68
              申請人: 南京大學
              發明人: 耿金菊; 張瀅楹; 任洪強; 莊耀
              地址: 210023江蘇省南京市棲霞區仙林大道163號
              優先權: 2014106803704 2014.11.25 CN
              專利代理機構: 代理人:
              PDF完整版下載: PDF下載
              法律狀態
              申請(專利)號:

              CN201510116739.3

              授權公告號:

              |||

              法律狀態公告日:

              2015.07.08|||2015.06.10

              法律狀態類型:

              實質審查的生效|||公開

              摘要

              本發明公開了基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法,采用紫外和氯化聯合工藝,達到去除污水中抗生素抗性基因的方法,具體的步驟如下:采集含有抗生素抗性基因的污水至滅菌容器中,將水樣分別進行紫外光照15s、30s;光照后立即加入NaClO使游離氯分別達到5、20、40mg/L,攪拌,反應120min后加入Na2S2O3以終止反應;取水樣用膜過濾;將富集微生物的膜剪碎,提取DNA;定量PCR,檢測抗生素抗性基因ARGs的含量。本方法采用UV及氯化聯合技術可以產生協同作用,在常規的UV、氯化消毒劑量下較為有效的增加對目標基因的去除率,氯化劑量越小時,協同作用越大。

              權利要求書

              權利要求書
              1.  基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法,其特征在于,采用紫 外和氯化聯合工藝,達到去除污水中抗生素抗性基因的方法,具體的步驟如下:
              (1)水樣預處理
              采集含有抗生素抗性基因的污水至滅菌容器中;
              (2)消毒
              在室溫下,將上述步驟(1)采集的水樣分別進行紫外光照15s、30s,相 應的UV劑量分別為62mJ/cm2、125mJ/cm2;光照后立即加入NaClO使游離氯 分別達到5mg/L、20mg/L、40mg/L,使用攪拌器攪拌,反應120min后加入 1.5%的Na2S2O3以終止反應;
              (3)膜過濾
              取200mL上述步驟(2)處理的水樣,用0.22μm混合纖維濾膜過濾;過 濾后保留濾膜并置于50%乙醇中于-20℃保存以待后續的DNA提取以及隨之的 基因定量;
              (4)DNA提取
              將富集微生物的膜剪碎,提取DNA;
              (5)定量PCR
              使用實時定量聚合酶鏈式反應PCR法對四環素類抗性基因tetX、tetG、磺 胺類抗性基因sul、1型整合子編碼基因intIl及16S rDNA作出定量,所述的定 量步驟包括:a)配制PCR反應體系溶液;b)使用PCR擴增儀進行擴增;c)PCR 后產物進行瓊脂糖凝膠電泳;d)測定PCR產物濃度;
              (6)檢測抗生素抗性基因ARGs的含量并分析結果。

              2.  根據權利要求1所述的基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法, 其特征在于,所述的紫外消毒采用有機玻璃制成的圓柱形光化學反應器,圓柱 形光化學反應器中間豎直放置石英套管,石英套管內放置紫外燈,石英套管外 壁254nm處的紫外光強為9.85mW/cm2,紫外線有效劑量為4.159mW/cm2。

              3.  根據權利要求1所述的基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法, 其特征在于,所述的DNA提取具體步驟如下:
              a)將濾膜在室溫下解凍并剪碎加入裂解管E管中;
              b)向上述管中加入978μL磷酸鈉緩沖液,及122μL MT Buffer;
              c)將E管放在FastPrep中以速度為6.0m/s振蕩40s。隨后將E管放置在離 心機中以14,000×g離心10min;
              d)離心后,將上清液轉移新的2mL離心管中,加入250μL蛋白沉淀溶液, 手搖10次離心管混合溶液;
              e)將離心管放入離心機以14000×g離心5min,將上清液轉移至15mL離 心管,并加入1mL DNA結合溶液,促進DNA與硅膠結合,將離心管上下顛倒 2min,隨后將離心管放至在架子上靜置3min;
              f)小心去除500μL的上清液,重新懸浮剩余的混合液;轉移約600μL的混 合液到含SPINTM Filter的管中,以14000×g離心1min;接著將SPINTM Filter 管中的液體倒掉;重復上述過程直到剩余混合液全部轉移離心完;
              g)加入500μL SEWS-M,溶解和清洗DNA至SPINTM Filter管中,用移液 槍吹打使沉淀物重新懸浮后以14000×g離心1min;將SPINTM Filter管中的液 體倒掉,再以14000×g離心2min,去除基質中的SEWS-M;
              h)將SPINTM Filter放到新的Catch Tube中,于室溫下風干5min后加入80μL  DES,用移液槍槍頭在濾膜上輕輕攪動,使濾膜上的沉淀物重新懸浮后以14000 ×g離心1min,DNA則轉移至Catch Tube中;
              i)將提取的DNA于-20℃或在4℃保存,用于接下來的PCR擴增及其他 步驟。

              4.  根據權利要求1所述的基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法, 其特征在于,所述的PCR反應體系溶液為25μL,包括:2.5μL 10×PCR緩沖 液,2μL MgCl2,2μL dNTP混合劑,上下引物各0.2μL,0.125μL Ex Taq DNA 聚合酶,2μL DNA模板,即提取的DNA稀釋至約20ng/μL,及ddH2O使體系 至25μL。

              5.  根據權利要求1所述的基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法, 其特征在于,使用PCR擴增儀進行擴增,反應溫度程序為94℃變性5min后進 入35個循環,每個循環中,先在94℃反應45s,隨之在退火溫度下反應45s, 之后在72℃下反應90s,循環反應之后再于72℃下反應10min,實驗中ARGs 的擴增效率在90%~100%之間,標曲相關系數R2均大于0.99。

              6.  根據權利要求1所述的基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法, 其特征在于,PCR后產物進行瓊脂糖凝膠電泳,以觀測是否有目標ARGs的擴 增產物,對于含有目標ARGs的PCR產物進行純化,后進行質粒制備。

              7.  根據權利要求6所述的基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法, 其特征在于,瓊脂糖凝膠電泳的具體步驟為:
              稱取0.3g瓊脂糖于錐形瓶中,加入1×TAE 30mL,加熱爐加熱瓊脂糖,加 熱均勻后待溶液冷卻至30℃左右時向溶液中加入2μL溴化乙錠,隨后將溶液 倒入膠床內,插入梳子,放置60min左右待凝膠固化。將凝膠放入電泳槽中, 加入l×TAE溶液,使溶液沒過凝膠1-2mm。將1μL Loading Buffer與5μL的 PCR產物混合均勻,加入凝膠中上樣孔中。蓋上泳槽,接通電源,在100V電 泳25min,電泳結束后,取出凝膠在凝膠成像儀上觀測結果。

              8.  根據權利要求6所述的基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法, 其特征在于,PCR產物純化具體步驟為:
              a)在PCR產物溶液中,加入3倍產物體積Buffer PCR-A,混勻后轉移至PCR 制備管,將PCR制備管置于提供好的2mL離心管中,以12000×g離心1min, 并棄掉濾液;
              b)將PCR制備管置回2mL離心管,加700μL Buffer W2,以12000×g離 心1min,棄濾液。隨后加入400μL Buffer W2,以12000×g離心1min;
              c)將制備管置于1.5mL潔凈離心管,在制備管膜中央加25-30μL Eluent或 去離子水,室溫靜置1min,隨后以12000×g離心1min洗脫DNA。

              9.  根據權利要求1所述的基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法, 其特征在于,使用超微量紫外分光光度計測定PCR產物濃度,計算其摩爾數:

              使用pMD 18-T Vector構建ARGs質粒,具體操作如下:
              a)在微量離心管中配置5μL體系,包括:1μL pMD 18-T Vector,0.1pmol~0.3 pmol Insert DNA,以及適量的ddH2O使體系至5μL。加入5μL的Solution I, 16℃反應30min;
              b)全量即10μL加入至100μL JM109感受態細胞中,冰中放置30min。隨 后42℃加熱45s后冰中放置1min;
              c)加入890μLSOC培養基,37℃振蕩培養60min。將100μL培養液轉移 至含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養形成單菌落,計數白色、 藍色菌落;
              d)挑選白色菌落使用PCR法確認載體中插入片段長度,使用質粒提取試劑 盒提取菌落質粒。

              10.  根據權利要求1所述的基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方 法,其特征在于,ARGs實時定量PCR檢測的步驟為:
              提取的質粒經10倍稀釋后作為qPCR反應的標準品,使用實時定量PCR儀對 檢測目標ARGs,每個qPCR反應都含有包括4~5個標準點的標準曲線,20μL 的qPCR的反應體系包括:10μL 2×powerGreen PCR混合染料,上 下引物各0.16μL,2μL模板DNA,提取的DNA稀釋至約2ng/μL,7.68μL  ddH2O。反應時間溫度設置包括95℃反應10min后進入40個循環,每個循 環中,95℃反應15s后在退火溫度下反應1min,反應后,儀器根據標準曲 線給出ARGs拷貝數,繼而反推至原水中ARGs含量。

              說明書

              說明書基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法
              技術領域
              本發明涉及環境保護的水處理領域,特別是涉及一種消毒技術對污水中抗生 素抗性基因的凈化方法。
              背景技術
              抗生素抗性基因(Antibtiotics Resistance Genes,ARGs)是一種新型污染物, 城市污水處理廠作為ARGs的重要儲存場所,其出水也是ARGs排入水環境中 的重要污染源,控制污水處理廠出水中ARGs對減少環境中ARGs污染,降低 ARGs的生態風險具有重要意義。
              消毒技術是處理城市污水中病原微生物,保證污水安全排放及回用的重要 工藝段,常用的消毒工藝有氯消毒、UV、臭氧消毒。現有關于污水廠中氯化、 UV消毒對ARGs的去除影響的報道多集中于對污水處理廠水樣進行直接的監 測,相關的氯化、UV劑量等操作參數并不明確。
              發明內容
              本發明為了解決去除污水中的抗生素抗性基因的問題,提供了一種基于消 毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法,具體考察了UV、氯化聯合消毒工藝 對污水中ARGs去除的影響。
              解決上述技術問題的技術方案如下:
              基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法,其特征在于,采用紫外 和氯化聯合工藝,達到去除污水中抗生素抗性基因的方法,具體的步驟如下:
              (1)水樣預處理
              采集含有抗生素抗性基因的污水至滅菌容器中;
              (2)消毒
              在室溫下,將上述步驟(1)采集的水樣分別進行紫外光照15s、30s,則 UV劑量分別為62mJ/cm2、125mJ/cm2;光照后立即加入NaClO使游離氯分別達 到5、20、40mg/L,使用攪拌器攪拌,反應120min后加入1.5%的Na2S2O3以 終止反應;
              (3)膜過濾
              取200mL上述步驟(2)的水樣,用0.22μm混合纖維濾膜過濾;過濾后保 留濾膜并置于50%乙醇中于-20℃保存以待后續的DNA提取以及隨之的基因定 量;
              (4)DNA提取
              將富集微生物的膜剪碎,提取DNA;
              (5)定量PCR
              使用實時定量聚合酶鏈式反應PCR法對四環素類抗性基因tetX、tetG、磺 胺類抗性基因sul、1型整合子編碼基因intI1及16S rDNA作出定量,所述的定 量步驟包括:a)配制PCR反應體系溶液;b)使用PCR擴增儀進行擴增;c)PCR 后產物進行瓊脂糖凝膠電泳;d)測定PCR產物濃度;
              (6)檢測抗生素抗性基因ARGs的含量并分析結果。
              優選地,所述的紫外消毒采用有機玻璃制成的圓柱形光化學反應器,圓柱 形光化學反應器中間豎直放置石英套管,石英套管內放置紫外燈,石英套管外 壁254nm處的紫外光強為9.85mW/cm2,紫外線有效劑量為4.159mW/cm2。
              優選地,所述的NaClO的有效氯≥8%。
              優選地,所述的DNA提取具體步驟如下:
              a)將濾膜在室溫下解凍并剪碎加入裂解管E管中;
              b)向上述管中加入978μL磷酸鈉緩沖液,及122μL MT Buffer;
              c)將E管放在FastPrep中以速度為6.0m/s振蕩40s。隨后將E管放置在離 心機中以14000×g離心10min;
              d)離心后,將上清液轉移新的2mL離心管中,加入250μL蛋白沉淀溶液, 手搖10次離心管混合溶液;
              e)將離心管放入離心機以14000×g離心5min,將上清液轉移至15mL離 心管,并加入1mL DNA結合溶液,促進DNA與硅膠結合,將離心管上下顛倒 2min,隨后將離心管放至在架子上靜置3min;
              f)小心去除500μL的上清液,重新懸浮剩余的混合液;轉移約600μL的混 合液到含SPINTMFilter的管中,以14000×g離心1min;接著將SPINTMFilter 管中的液體倒掉;重復上述過程直到剩余混合液全部轉移離心完;
              g)加入500μL SEWS-M,溶解和清洗DNA至SPINTMFilter管中,用移液 槍吹打使沉淀物重新懸浮后以14000×g離心1min;將SPINTMFilter管中的液 體倒掉,再以14000×g離心2min,去除基質中的SEWS-M;
              h)將SPINTMFilter放到新的Catch Tube中,于室溫下風干5min后加入80μL  DES,用移液槍槍頭在濾膜上輕輕攪動,使濾膜上的沉淀物重新懸浮后以14000 ×g離心1min,DNA則轉移至Catch Tube中;
              i)將提取的DNA于-20℃或在4℃保存,用于接下來的PCR擴增及其他 步驟。
              優選地,所述的PCR反應體系溶液為25μL,包括:2.5μL 10×PCR緩沖 液,2μL MgCl2,2μL dNTP混合劑,上下引物各0.2μL,0.125μL Ex Taq DNA 聚合酶,2μL DNA模板,即提取的DNA稀釋至約20ng/μL,及ddH2O使體系 至25μL。
              優選地,使用PCR擴增儀進行擴增,反應溫度程序為94℃變性5min后進 入35個循環,每個循環中,先在94℃反應45s,隨之在退火溫度下反應45s, 之后在72℃下反應90s,循環反應之后再于72℃下反應10min,實驗中ARGs 的擴增效率在90%~100%之間,標曲相關系數R2均大于0.99。
              優選地,PCR后產物進行瓊脂糖凝膠電泳,以觀測是否有目標ARGs的擴增 產物,對于含有目標ARGs的PCR產物進行純化,后進行質粒制備。
              優選地,瓊脂糖凝膠電泳的具體步驟為:
              稱取0.3g瓊脂糖于錐形瓶中,加入1×TAE 30mL,加熱爐加熱瓊脂糖,加 熱均勻后待溶液冷卻至30℃左右時向溶液中加入2μL溴化乙錠,隨后將溶液 倒入膠床內,插入梳子,放置60min左右待凝膠固化。將凝膠放入電泳槽中, 加入1×TAE溶液,使溶液沒過凝膠1-2mm。將1μL Loading Buffer與5μL的 PCR產物混合均勻,加入凝膠中上樣孔中。蓋上泳槽,接通電源,在100V電 泳25min,電泳結束后,取出凝膠在凝膠成像儀上觀測結果。
              優選地,PCR產物純化具體步驟為:
              a)在PCR產物溶液中,加入3倍產物體積Buffer PCR-A,混勻后轉移至PCR 制備管,將PCR制備管置于提供好的2mL離心管中,以12000×g離心1min, 并棄掉濾液;
              b)將PCR制備管置回2mL離心管,加700μL Buffer W2,以12000×g離 心1min,棄濾液。隨后加入400μL Buffer W2,以12000×g離心1min;
              c)將制備管置于1.5mL潔凈離心管,在制備管膜中央加25-30μL Eluent或 去離子水,室溫靜置1min,隨后以12000×g離心1min洗脫DNA。
              優選地,使用超微量紫外分光光度計測定PCR產物濃度,計算其摩爾數:

              使用pMD 18-T Vector構建ARGs質粒,具體操作如下:
              a)在微量離心管中配置5μL體系,包括:1μL pMD 18-T Vector,0.1pmol~0.3 pmol Insert DNA,以及適量的ddH2O使體系至5μL。加入5μL的Solution I, 16℃反應30min;
              b)全量即10μL加入至100μL JM109感受態細胞中,冰中放置30min。隨 后42℃加熱45s后冰中放置1min;
              c)加入890μL SOC培養基,37℃振蕩培養60min。將100μL培養液轉移 至含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養形成單菌落,計數白色、 藍色菌落;
              d)挑選白色菌落使用PCR法確認載體中插入片段長度,使用質粒提取試劑 盒提取菌落質粒。
              優選地,ARGs實時定量PCR檢測的步驟為:
              提取的質粒經10倍稀釋后作為qPCR反應的標準品,使用實時定量PCR儀對 檢測目標ARGs,每個qPCR反應都含有包括4~5個標準點的標準曲線,20μL 的qPCR的反應體系包括:10μL 2×powerGreen PCR混合染料,上 下引物各0.16μL,2μL模板DNA,提取的DNA稀釋至約2ng/μL,7.68μL  ddH2O。反應時間溫度設置包括95℃反應10min后進入40個循環,每個循 環中,95℃反應15s后在退火溫度下反應1min,反應后,儀器根據標準曲 線給出ARGs拷貝數,繼而反推至原水中ARGs含量。
              優選地,ARGs去除率分析步驟如下:
              本發明中基因的濃度單位為單位體積水樣中基因的拷貝數,即copies/mL;

              其中,j代表特定的基因,包括tetX、tetG、sul或intI1、16S rDNA;
              特定基因j處理前在水樣中的原始拷貝數(copies/mL);
              特定基因j混凝后在水樣中的拷貝數(copies/mL);
              使用SPSS17.0對數據進行顯著性分析。
              有益效果:
              對于ARGs的去除主要取決于對DNA結構的損傷(胞內DNA及胞外DNA)。
              UV及氯化聯合技術對ARGs去除的影響如附圖2所示,UV輻照后,向污 水中繼續投加游離氯(Free Cholride,FC)進行氯化消毒,考察二者的協同作用。 聯合消毒的協同作用計算如下:協同作用去除的log值=聯合工藝去除的總log 值-單獨UV去除的log值-單獨氯化去除的log值。在低劑量的UV和氯化作 用下,二者對目標基因的去除均有協同作用,對ARGs、intI1、16S rDNA的去 除可分別增加0.03~0.79log、0.15~1.30log、0.11~0.52log。總體而言,氯化 劑量越小,輻照劑量越大時,協同作用越大。協同作用的產生是因為UV可降 低生物活性,使后續的氯化過程中,有效氯能更易與細胞反應。此外,UV后進 行氯化消毒可以產生持續消毒的作用。
              該方法符合城市污水深度處理和回用的需求,符合促進經濟、社會和環境 可持續發展的國家重大需求,重點處理廢水中毒害污染物--抗生素抗性基因和病 原微生物,利用先進的技術組合,將UV及氯化聯合消毒技術應用在廢水處理中, 找到了精確的UV及氯化聯合技術劑量等操作參數,有效去除抗性基因,為污水 深度處理和水質安全保障提供理論支持和技術保障,填補了國內外所屬領域的 技術空白。
              附圖說明
              下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。
              圖1為本發明的工藝流程圖;
              圖2為UV及氯化聯合工藝對目標基因去除的影響:1-3分別為UV輻照62 mJ/cm2后投加5,20,40mg/L有效氯進行消毒;4-6分別為UV輻照125mJ/cm2后投加5,20,40mg/L有效氯進行消毒;
              具體實施方式
              如圖1所示的一種基于消毒技術去除污水中抗生素抗性基因的方法,從南 京某城市污水處理廠中取水樣,該廠采用循環式活性污泥法(CAST)工藝。采 集CAST工藝上清液(二級出水),進行消毒實驗。水質情況及水樣中初始ARGs 含量如表1和表2所示。
              表1消毒處理水樣水質

              表2消毒前水樣中基因含量(copies/mL)

              將采集的水樣在室內溫度(20±2℃)下分別進行UV光照15s和30s, 即UV劑量分別為62mJ/cm2、125mJ/cm2;光照后立即加入NaClO使有機氯FC 分別達到5、20、40mg/L,使用攪拌器攪拌,反應120min后加入Na2S2O3(1.5%) 以終止反應,取200mL水樣用0.22μm混合纖維濾膜過濾,過濾后保留富集微 生物的濾膜并將其放在50%乙醇中于-20℃保存,將富集微生物的濾膜剪碎, 提取DNA,再進行定量PCR,檢測ARGs的含量,計算ARGs的去除率。
              其中,UV光照的實驗裝置采用圓柱形光化學反應器,反應器由有機玻璃制 成,高31cm,主體直徑9cm,反應器中間豎直放置石英套管,石英管內放置 紫外燈,石英管外壁254nm處的紫外光強為9.85mW/cm2。紫外線有效劑量經 核算為4.159mW/cm2。
              其中,UV輻射強度測定采用UV-C型紫外輻照計測定,UV有效劑量計算公式 為:
              I=I0[(1-10-A·d)/2.3Ad]
              式中:
              I-UV有效劑量,mW/cm2;
              IO-UV波長為254nm時水樣表面的紫外線光強,mW/cm2;
              A-UV波長為254nm時水樣的吸光度;
              d-水層厚度,cm。
              進一步地,DNA提取按照Fast DNATM Spin Kit for soil試劑盒廠家提供 方法進行,具體步驟如下:
              a)將濾膜在室溫下解凍并剪碎加入裂解管E管中(Lysing Matrix E tube)。
              b)向上述管中加入978μL磷酸鈉緩沖液(Sodium Phosphate Buffer), 及122μL MT Buffer。
              c)將E管放在FastPrep中以速度為6.0m/s振蕩40s。隨后將E管放置 在離心機中以14000×g離心10min。
              d)離心后,將上清液轉移新的2mL離心管中,加入250μL蛋白沉淀溶液 (protein precipitation solution),手搖10次離心管混合溶液。
              e)將離心管放入離心機以14000×g離心5min,將上清液轉移至15mL 離心管,并加入1mL DNA結合溶液(Binding Matrix,促進DNA與硅膠結合)。 將離心管上下顛倒2min,隨后將離心管放至在架子上靜置3min。
              f)小心去除500μL的上清液,重新懸浮剩余的混合液;轉移約600μL 的混合液到含SPINTM Filter的管中,以14000×g離心1min;接著將SPINTM  Filter管中的液體倒掉;重復上述過程直到剩余混合液全部轉移離心完。
              g)加入500μL SEWS-M(溶解和清洗DNA)至SPINTM Filter管中,用移 液槍吹打使沉淀物重新懸浮后以14000×g離心1min;將SPINTM Filter管 中的液體倒掉,再以14000×g離心2min,去除基質中的SEWS-M。
              h)將SPINTM Filter放到新的Catch Tube中,于室溫下風干5min后加入 80μL DES(DNase/Pyrogen Free Water),用移液槍槍頭在濾膜上輕輕攪動, 使濾膜上的沉淀物重新懸浮后以14000×g離心1min,DNA則轉移至Catch Tube 中。
              i)將提取的DNA于-20℃或在4℃保存,用于接下來的PCR擴增及其他 步驟。
              進一步地,PCR即聚合酶鏈反應(Polymerase Chain reaction)。本發明中 使用的PCR反應體系溶液為25μL,包括:2.5μL 10×PCR緩沖液,2μL MgCl2, 2μL dNTP混合劑,上下引物各0.2μL(20μM),0.125μL Ex Taq DNA聚合 酶,2μL DNA模板(提取的DNA稀釋至約20ng/μL)及ddH2O使體系至25μL。
              使用PCR擴增儀進行擴增,反應溫度程序為94℃變性5min后進入35個 循環,每個循環中,先在94℃反應45s,隨之在退火溫度下反應45s,之后 在72℃下反應90s,循環反應之后再于72℃下反應10min。PCR及后面定 量PCR中使用的引物如表3示。實驗中ARGs的擴增效率在90%~100%之間,標 曲相關系數R2均大于0.99。
              表3PCR及定量PCR引物

              進一步地,PCR后產物進行瓊脂糖凝膠電泳,以觀測是否有目標ARGs的擴 增產物,對于含有目標ARGs的PCR產物進行純化,后進行質粒制備。
              瓊脂糖凝膠電泳的具體步驟為:
              稱取0.3g瓊脂糖于錐形瓶中,加入1×TAE 30mL。加熱爐加熱瓊脂糖,加 熱均勻后待溶液冷卻至30℃左右時向溶液中加入2μL溴化乙錠,隨后將溶液 倒入膠床內,插入梳子,放置60min左右待凝膠固化。將凝膠放入電泳槽中, 加入1×TAE溶液,使溶液沒過凝膠1-2mm。將1μL Loading Buffer與5μL的 PCR產物混合均勻,加入凝膠中上樣孔中。蓋上泳槽,接通電源,開始電泳(100 V,25min)。電泳結束后,取出凝膠在凝膠成像儀上觀測結果。
              按照AxyPrep PCR清潔試劑盒操作指南進行PCR產物純化。
              a)在PCR產物溶液中,加入3倍產物體積Buffer PCR-A,混勻后轉移至PCR 制備管,將PCR制備管置于提供好的2mL離心管中,以12000×g離心1min, 并棄掉濾液。
              b)將PCR制備管置回2mL離心管,加700μL Buffer W2,以12000×g離 心1min,棄濾液。隨后加入400μL Buffer W2,以12000×g離心1min。
              c)將制備管置于1.5mL潔凈離心管,在制備管膜中央加25-30μL Eluent或 去離子水,室溫靜置1min,隨后以12000×g離心1min洗脫DNA。
              進一步地,使用超微量紫外分光光度計測定PCR產物濃度,計算其摩爾數:

              使用pMD 18-T Vector構建ARGs質粒。具體操作如下:
              a)在微量離心管中配置5μL體系,包括:1μL pMD 18-T Vector,0.1pmol~0.3 pmol Insert DNA,以及適量的ddH2O使體系至5μL。加入5μL的Solution I, 16℃反應30min。
              b)全量(10μL)加入至100μL JM109感受態細胞中,冰中放置30min。 隨后42℃加熱45s后冰中放置1min。
              c)加入890μL SOC培養基,37℃振蕩培養60min。將100μL培養液轉移 至含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養形成單菌落,計數白色、 藍色菌落。
              d)挑選白色菌落使用PCR法確認載體中插入片段長度。使用質粒提取試劑 盒提取菌落質粒。
              ARGs實時定量PCR檢測(qPCR)
              提取的質粒經10倍稀釋后作為qPCR反應的標準品。使用實時定量PCR儀 對檢測目標ARGs,每個qPCR反應都含有包括4~5個標準點的標準曲線,20μL 的qPCR的反應體系包括:10μL 2×powerGreen PCR混合染料,上下引 物各0.16μL(20μM),2μL模板DNA(提取的DNA稀釋至約2ng/μL),7.68 μL ddH2O。反應時間溫度設置包括95℃反應10min后進入40個循環,每個循 環中,95℃反應15s后在退火溫度下反應1min。反應后,儀器根據標準曲線 給出ARGs拷貝數,繼而反推至原水中ARGs含量。
              ARGs去除率分析
              本發明中基因的濃度單位為單位體積水樣中基因的拷貝數,即copies/mL。

              其中,j代表特定的基因,包括tetX、tetG、sul或intI1、16S rDNA。
              特定基因j處理前在水樣中的原始拷貝數(copies/mL);
              特定基因j混凝后在水樣中的拷貝數(copies/mL)。
              使用SPSS17.0對數據進行顯著性分析。
              優選地,PCR產物純化具體步驟為:
              a)在PCR產物溶液中,加入3倍產物體積Buffer PCR-A,混勻后轉移至PCR 制備管,將PCR制備管置于提供好的2mL離心管中,以12000×g離心1min, 并棄掉濾液;
              b)將PCR制備管置回2mL離心管,加700μL Buffer W2,以12000×g離 心1min,棄濾液。隨后加入400μL Buffer W2,以12000×g離心1min;
              c)將制備管置于1.5mL潔凈離心管,在制備管膜中央加25-30μL Eluent或 去離子水,室溫靜置1min,隨后以12000×g離心1min洗脫DNA。
              優選地,使用超微量紫外分光光度計測定PCR產物濃度,計算其摩爾數:

              使用μMD 18-T Vector構建ARGs質粒,具體操作如下:
              a)在微量離心管中配置5μL體系,包括:1μL pMD 18-T Vector,0.1pmol~0.3 pmol Insert DNA,以及適量的ddH2O使體系至5μL。加入5μL的Solution I, 16℃反應30min;
              b)全量即10μL加入至100μL JM109感受態細胞中,冰中放置30min。隨 后42℃加熱45s后冰中放置1min;
              c)加入890μL SOC培養基,37℃振蕩培養60min。將100μL培養液轉移 至含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養形成單菌落,計數白色、 藍色菌落;
              d)挑選白色菌落使用PCR法確認載體中插入片段長度,使用質粒提取試劑 盒提取菌落質粒。
              優選地,ARGs實時定量PCR檢測的步驟為:
              提取的質粒經10倍稀釋后作為qPCR反應的標準品,使用實時定量PCR儀對 檢測目標ARGs,每個qPCR反應都含有包括4~5個標準點的標準曲線,20μL 的qPCR的反應體系包括:10μL 2×powerGreen PCR混合染料,上 下引物各0.16μL,2μL模板DNA,提取的DNA稀釋至約2ng/μL,7.68μL  ddH2O。反應時間溫度設置包括95℃反應10min后進入40個循環,每個循 環中,95℃反應15s后在退火溫度下反應1min,反應后,儀器根據標準曲 線給出ARGs拷貝數,繼而反推至原水中ARGs含量。
              優選地,ARGs去除率分析步驟如下:
              本發明中基因的濃度單位為單位體積水樣中基因的拷貝數,即copies/mL;

              其中,j代表特定的基因,包括tetX、tetG、sul或intI1、16S rDNA;
              特定基因j處理前在水樣中的原始拷貝數(copies/mL);
              特定基因j混凝后在水樣中的拷貝數(copies/mL);
              使用SPSS17.0對數據進行顯著性分析。

              關 鍵 詞:
              基于 消毒 技術 去除 污水 抗生素 抗性 基因 方法
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