<progress id="rrzp7"></progress>
        <big id="rrzp7"><meter id="rrzp7"></meter></big>
          <progress id="rrzp7"><menuitem id="rrzp7"></menuitem></progress>

            <big id="rrzp7"><menuitem id="rrzp7"></menuitem></big>

            <progress id="rrzp7"></progress>

              • / 7
              • 下載費用:20 金幣  

              一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應用.pdf

              摘要
              申請專利號:

              CN201510150327.1

              申請日:

              2015.03.31

              公開號:

              CN104725504A

              公開日:

              2015.06.24

              當前法律狀態:

              實審

              有效性:

              審中

              法律詳情: 實質審查的生效IPC(主分類):C07K 16/10申請日:20150331|||公開
              IPC分類號: C07K16/10; C07K16/02 主分類號: C07K16/10
              申請人: 華中農業大學; 深圳市鴻鵠科技發展有限公司
              發明人: 林蠡; 伊麗竹; 秦真東; 周洋; 鄧俊杰; 譚銳敏
              地址: 430070湖北省武漢市洪山區獅子山街1號
              優先權:
              專利代理機構: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司42102 代理人: 喬宇
              PDF完整版下載: PDF下載
              法律狀態
              申請(專利)號:

              CN201510150327.1

              授權公告號:

              |||

              法律狀態公告日:

              2015.07.22|||2015.06.24

              法律狀態類型:

              實質審查的生效|||公開

              摘要

              本發明屬于生物技術領域,具體涉及一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應用。所述卵黃抗體由下述方法制備:將羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白基因重組到GST融合基因表達載體pGEX-5x-1中,構建成pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒;將pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒轉化大腸桿菌并誘導融合基因表達;采用包涵體提純技術提取并純化得到GST-MrNV-CP重組蛋白;用GST-MrNV-CP重組蛋白免疫母雞,收集雞蛋并從雞蛋中提取卵黃抗體。本發明所制備的卵黃抗體能夠有效抑制羅氏沼蝦野田病毒,效價高,具有良好的免疫保護效力,可以在蝦類的蝦苗期,將其作為羅氏沼蝦野田病毒疫苗添加到羅氏沼蝦飼料中。

              權利要求書

              權利要求書
              1.  一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,其特征在于,由下述方法制備得到:
              (1)通過RT-PCR方法克隆羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白基因的cDNA,然后重組到谷胱甘肽S-轉移酶融合基因表達載體pGEX-5x-1中,構建成pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒,所述pGEX-5x-1-MrNV-CP 重組質粒中含有谷胱甘肽S-轉移酶和羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白的融合基因;
              (2)重組質粒pGEX-5x-1-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達:將pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒轉化大腸桿菌,次日挑選轉化平板上的大腸桿菌單菌落于含有卡那霉素的培養基中擴大培養,利用IPTG誘導谷胱甘肽S-轉移酶和羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白的融合基因在大腸桿菌中表達;收集菌體,采用包涵體提純技術提取并純化得到GST-MrNV-CP重組蛋白;
              (3)用GST-MrNV-CP重組蛋白免疫產蛋母雞,收集免疫母雞所產雞蛋,從所收集的雞蛋中提取并純化卵黃抗體。

              2.  根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,其特征在于,所述GST-MrNV-CP重組蛋白的分子量為66kDa~68kDa。

              3.  根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,其特征在于,所述RT-PCR方法為:以羅氏沼蝦野田病毒為模板,將羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白基因反轉錄成第一鏈cDNA,再用特異性引物擴增得到雙鏈DNA。

              4.  根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,其特征在于,所述pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒的構建方法為:將DNA和pGEX-5x-1載體分別進行雙酶切,再進行連接反應得到含有谷胱甘肽S-轉移酶和羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白的融合基因的pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒。

              5.  根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,其特征在于,所述重組質粒pGEX-5x-1-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達為:pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒轉化大腸桿菌,次日挑選轉化平板上的單菌落于含有卡那霉素的LB液體培養基中,于37℃、200轉/分鐘進行恒溫搖床培養,當大腸桿菌的OD值達到0.4~0.6 時,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,在25~37℃誘導4~8小時。

              6.  根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,其特征在于,所述免疫為兩翅及兩側胸肌注射。

              7.  根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,其特征在于,所述免疫的次數為3次,每次免疫的時間間隔為2周。

              8.  根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,其特征在于,所述免疫方式為:首次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與等體積完全弗氏佐劑乳化成的疫苗,第二次及第三次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與不完全弗氏佐劑乳化成的疫苗。

              9.  根據權利要求1所述的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,其特征在于,步驟(3)所述從雞蛋中提取并純化卵黃抗體的方法為:將所收集雞蛋的蛋清和蛋黃分離,取蛋黃,去掉卵黃膜,然后加入滅菌蒸餾水,充分搖勻、置于4℃條件下過夜后,收集上清即為卵黃抗體。

              10.  權利要求1~9任一所述羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體在制備蝦用抗羅氏沼蝦野田病毒疫苗制品中的應用。

              說明書

              說明書一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應用
              發明領域
              本發明屬于生物技術領域,具體涉及一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應 用。
              技術背景
              羅氏沼蝦原產于印度太平洋地區,生活在各種類型的淡水或咸淡水水域。1976年自我國 首次引進該品種,目前主要在南方l0多個省(市、區)推廣養殖。其生長速度快,食譜廣,營 養豐富,是一種重要經濟蝦類;至2000年,我國羅氏沼蝦苗種產量己達近200億尾,產值 20多億元。由于養殖密度不斷提高、養殖水體污染日益嚴重及養殖品種種質退化,羅氏沼蝦 在育苗和養殖過程中疾病日益流行。90年代后期,羅氏沼蝦肌肉壞死病相繼在我國南方各省 暴發,并于20001年大面積流行。該病毒的感染對象為羅氏沼蝦幼苗,主要發病時期為蝦苗 淡化后1-2周內,死亡率高達60%以上,嚴重時可達100%。造成嚴重的經濟損失,至今仍 沒有可以有效控制此病的方法。研究表明,該病病原為野田村病毒,命名為羅氏沼蝦野田病 毒(Macrobranchium rosenbergii nodavirus,MrNV)。病毒粒子呈廿面體,無囊膜,直徑為 23-25nm,病毒核酸為單鏈RNA,由2個片段組成,分別為RNA1(3.20kb)和RNA2(1.2kb)。 其中RNA2編碼衣殼蛋白,是病毒感染與致病力的重要蛋白,也是重要抗原。由于蝦類無法 自行產生抗體,因此普通的疫苗無法有效防治該疾病。卵黃抗體具有穩定性和高效性的特點, 是防治此類疾病的重要手段。
              目前關于羅氏沼蝦野田病毒的相關的專利,主要有下列報道:羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒 酶聯免疫診斷試劑盒及其檢測方法(申請公布號:CN1603830;申請號:031434282申請公布 號:CN1603830);羅氏沼蝦野田村病毒檢測試劑盒及檢測方法(申請公布號: CN103122393A;申請號:2012105024179);羅氏沼蝦諾達病毒核酸點雜交檢測的方法(申 請公布號:CN1438330;申請號:031187331);羅氏沼蝦病毒復合反轉錄多聚酶鏈反應檢 測的方法(申請公布號:CN1451764;申請號:031190898)。以上專利都是關于病毒的檢測, 沒有涉及卵黃抗體的制備。
              發明內容
              本發明的目的在于提供一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應用。
              為解決以上技術問題,本發明采用以下技術方案:
              一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體,由下述方法制備得到:
              (1)通過RT-PCR方法克隆羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白基因的DNA,然后重組到谷胱 甘肽S-轉移酶(GST)融合基因表達載體pGEX-5x-1中,構建成pGEX-5x-1-MrNV-CP重組 質粒,所述pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒中含有谷胱甘肽S-轉移酶和羅氏沼蝦野田病毒衣 殼蛋白的融合基因;
              (2)重組質粒pGEX-5x-1-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達:將pGEX-5x-1-MrNV-CP重 組質粒轉化大腸桿菌,次日挑選轉化平板上的大腸桿菌單菌落于含有卡那霉素的培養基中擴 大培養,利用IPTG誘導谷胱甘肽S-轉移酶和羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白的融合基因在大腸 桿菌中表達;收集菌體,采用包涵體提純技術提取并純化得到GST-MrNV-CP重組蛋白;
              (3)用GST-MrNV-CP重組蛋白免疫產蛋母雞,收集免疫母雞所產雞蛋,從所收集的雞 蛋中提取并純化卵黃抗體。
              按上述方案,所述GST-MrNV-CP重組蛋白的分子量為66kDa~68kDa。
              按上述方案,所述RT-PCR方法為:以羅氏沼蝦野田病毒為模板,采用特異性引物將羅 氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白基因反轉錄成第一鏈cDNA,再PCR擴增得到雙鏈cDNA。
              按上述方案,所述pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒的構建方法為:將cDNA和pGEX-5x-1 載體分別進行雙酶切,再進行連接反應得到含有谷胱甘肽S-轉移酶和羅氏沼蝦野田病毒衣殼 蛋白的融合基因的pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒。
              按上述方案,所述重組質粒pGEX-5x-1-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達為: pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒轉化大腸桿菌,次日挑選轉化平板上的單菌落于含有卡那霉 素的LB液體培養基中,于37℃、200轉/分鐘進行恒溫搖床培養,當大腸桿菌的OD值達到 0.4-0.6時,加入終濃度為1mmol/L的IPTG,在25-37℃誘導4-8小時。
              按上述方案,所述免疫為兩翅及兩側胸肌注射。
              按上述方案,所述免疫的次數為3次,每次免疫的時間間隔為2周。
              按上述方案,所述免疫方式為:首次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與等體積完全 弗氏佐劑乳化成的疫苗,第二次及第三次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與不完全弗氏 佐劑乳化成的疫苗。
              按上述方案,步驟(3)所述從雞蛋中提取并純化卵黃抗體的方法為:將所收集雞蛋的 蛋清和蛋黃分離,取蛋黃,去掉卵黃膜,然后加入滅菌蒸餾水,充分搖勻、置于4℃條件下 過夜后,收集上清即為卵黃抗體。
              上述羅氏沼蝦野田病毒卵黃抗體在制備蝦用抗羅氏沼蝦野田病毒疫苗制品中的應用。
              本發明的有益效果:本發明方法制備得到的卵黃抗體表達量持續穩定,經羅氏沼蝦苗免 疫保護試驗證實,所制備的卵黃抗體能夠有效抑制羅氏沼蝦野田病毒,效價高,具有良好的 免疫保護效力,可以在蝦類的蝦苗期,將其作為羅氏沼蝦野田病毒疫苗添加到羅氏沼蝦飼料 中,為羅氏沼蝦野田病毒疫苗的商品化推廣提供了可能性,具有廣闊的應用前景。
              具體實施方式
              為了更好地理解本發明,下面結合實施例進一步闡明本發明的內容,但本發明的內容不 僅僅局限于下面的實施例。
              實施例1:羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白基因pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒的構建
              以羅氏沼蝦野田病毒感染的沼蝦肌肉提取的總RNA為模板,采用下游引物 MrNV-NotI-BW:5’-ATAGCGGCCGCCTAATTATTGCCGACGATAG-3’,將羅氏沼蝦野田病 毒衣殼蛋白基因進行RT-PCR反應生成第一鏈cDNA,RT-PCR反應的試劑為:反轉錄酶、 dNTP、緩沖液;條件為:75℃,5min;42℃,1小時;80℃,10min。隨后,將獲得的cDNA作 為模板,使用上游引物MrNV-SalI-FW:5’-CATGTCGACATGGCTAGAGGT AAACAA AA-3’ 和下游引物MrNV-NotI-BW:5’-TAGCGGCCGCCTAATTATTGCCGACGATAG-3’,PCR擴 增得到雙鏈DNA。PCR反應的試劑為:高保真DNA聚合酶、dNTP、緩沖液;PCR擴增反 應條件為:預變性95℃5min;隨后95℃,40s;61℃,40s;72℃,l min;共35個循環,隨后 在72℃延伸5min,4℃保存。將反應產物在1%的瓊脂糖上電泳分離,提純目的DNA片段。 隨后將提純的DNA片段和pGEX-5x-1載體分別用SalI和NotI雙酶切,用T4DNA連接酶將 酶切的DNA片段連接到酶切的pGEX-5x-1載體上,獲得到含有GST和羅氏沼蝦野田病毒衣 殼蛋白融合基因的pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒。所述連接反應體系為:DNA 2μl, pGEX-5x-16μl,10×連接緩沖液2μl,T4DNA連接酶1μl,16℃30分鐘。
              實施例2:重組質粒pGEX-5x-1-MrNV-CP在大腸桿菌中的表達
              將pGEX-5x-1-MrNV-CP重組質粒轉化大腸桿菌,次日挑選轉化平板上的單菌落于含有 50g/mL卡那霉素的LB液體培養基中,于37℃、200轉/分鐘進行恒溫搖床培養,當大腸桿 菌的OD值達到0.4-0.6時,加入終濃度為1mmol/L的IPTG,在25-37℃誘導4-8小時。6000 rpm離心10min,收集菌體。高壓破碎菌體,菌體破碎后的懸浮液經4℃,12,000rpm離心 10min,分別收集上清和沉淀。對收集的沉淀采用包涵體提純技術提取蛋白,具體操作步驟 如下:
              (1)沉淀使用20mL buffer A(50mM Tris-HCl,5mM EDTA,pH 8.0)充分懸起, 混勻,4℃離心10,000rpm 20min,去除上清;重復一次;
              (2)沉淀使用20mLbuffer B(50mM Tris-HCl,5mM EDTA,2M脲,pH8.0)充分 懸起,混勻,4℃冷凍離心10,000rpm 20min,去除上清;重復一次;
              (3)沉淀用1%的曲拉通分別洗滌,4℃冷凍離心10,000rpm 20min,去除上清;重復 一次;
              (4)沉淀使用20mL buffer C(0.1M Tris-HCl,10mM DTT,8M脲,pH8.0)充分懸 起,混勻,置于37℃恒溫搖床上以200rpm快速震蕩1h,4℃離心10,000rpm 10min, 保留上清,去除沉淀;
              (5)將上清裝入透析袋中,置于50倍體積透析液(0.1M Tris-HCl,5mM EDTA,5mM  Cysteins,pH8.0)中,4℃透析16h以上;再置于上述透析液(1L)中4℃透析16h以上, 4℃冷凍離心10,000rpm10min,保留上清,去除沉淀。然后采用SDS-PAGE檢測提取GST-CP 重組蛋白的濃度、純度以及重組蛋白的分子量,檢測結果顯示提取的重組蛋白的濃度可以達 到5毫克/毫升以上,純度達99%以上,重組蛋白的分子量為68kD。采用包涵體結合 SDS-PAGE方法提取重組蛋白的方法,可以快速獲得大量純化的重組蛋白,為后續制備卵黃 抗體提供便利。此外,由于GST分子量比較大(26kD),比起其它融合小肽(比如His-tag) 具有更好的免疫源性。
              實施例3:羅氏沼蝦野田病毒卵黃抗體的制備
              1.抗原的制備:將重組蛋白與等體積佐劑充分乳化(充分乳化后將乳化產物置于水 中,看其是否散開,不散開這說明乳化充分),首次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與等 體積完全弗氏佐劑乳化成的疫苗,第二次及第三次免疫注射由GST-MrNV-CP重組蛋白與不 完全弗氏佐劑乳化成的疫苗。
              2.免疫:選取健康母雞10羽,取1ml疫苗在母雞兩翅及兩側胸肌注射,每點注射 0.25ml,每2周免疫一次,具體的免疫程序見下表1,首免后即開始收集雞蛋,4℃保存備用, 選取免疫前的雞蛋為陰性對照。
              表1 免疫程序

              3.卵黃抗體水溶性組分(WSF)的提取純化:將收集的雞蛋,用5%的新潔爾滅殺菌 30min,晾干;用蛋黃分離器分離蛋黃,在濾紙上滾動,盡量去掉卵黃膜,用注射器吸取蛋 黃于量筒中,加入9倍體積預冷的滅菌蒸餾水,充分搖勻,4℃過夜,4℃,10000rpm/min離 心30min,收集上清即為卵黃抗體水溶性組分(WSF)。
              實施例4:羅氏沼蝦野田病毒卵黃抗體的效價測定
              將GST-MrNV-CP重組蛋白用pH=9.6的碳酸鹽緩沖液(Na2CO30.15g,NaHCO30.293g, 加雙蒸水90mL后用1mol/L的HCl調pH至9.6,最后定容至100mL)稀釋成10ng/mL包 被100μL于96孔酶標板,4℃過夜;用100μL 5%脫脂奶粉于37℃封閉2h,200μL洗滌 緩沖液PBST(PBS+0.05%Tween-20)洗滌4次,每次孵育3min,拍干。將實施例3制備的WSF 用pH=7.6的磷酸鹽緩沖液按1:6400、1:12800、1:25600、1:51200等梯度稀釋每孔加入 100μL 37℃孵育2h,以相應稀釋倍數的陰性WSF做對照;PBST洗滌4次,加入1∶5000稀 釋的HRP標記的兔抗雞IgG 100μL,37℃孵育1h;最后用TMB(3',3',5',5'-四甲 基聯苯胺)底物顯色試劑盒顯色20min,加入2mol/L的H2SO4終止顯色,在酶標儀(Infinite  M200PRO)上讀OD450值。P/N≥2.1,即為效價值,效價測定結果顯示,羅氏沼蝦野田病毒卵 黃抗體效價值為102400。
              實施例5:羅氏沼蝦野田病毒卵黃抗體的Western blot特異性檢測
              將GST-MrNV-CP重組蛋白通過SDS-PAGE分離,電泳結束后膠條割至合適大小,將膠和 濾紙用轉膜緩沖液處理,把預先裁好并用甲醇處理過的PVDF膜浸入轉膜緩沖液中,用半干 法將蛋白轉移至PVDF膜上,80mA,轉膜9min。轉膜完成后取出PVDF膜浸于含5%脫脂奶粉 的TBST中,液體必須覆蓋膜的全部,室溫搖床上封閉1h,用TBST洗膜3次,每次5min。 將膜浸入實施例3制備的羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白的WSF(1:400稀釋)中,室溫孵育1h, TBST洗膜3次每次5min,加入1:3000HRP標記的兔抗雞IgG,37℃孵育1h,洗滌后用DAB 顯色試劑盒顯色。結果表明存在特異性的卵黃抗體。
              實施例6:羅氏沼蝦苗免疫保護實驗
              (1)餌料制備:將雞蛋打碎,按照一個雞蛋加入50-100毫升水,將卵黃和蛋清充分攪 拌,在沸水中蒸10-15分鐘,制備成蝦苗的餌料;實驗組在上述餌料中按照每1公斤餌料加 入200微升含有卵黃抗體的血清量添加,對照組不加卵黃抗體;
              (2)投喂:餌料投喂羅氏沼蝦苗,每天6次,連續投喂一周;
              (3)攻毒:將蝦苗分成2組,一組是投喂了沒有卵黃抗體的餌料的蝦苗,一組是已經 投喂了有卵黃抗體餌料一周的蝦苗,在水中加入含有羅氏沼蝦野田病毒,進行浸泡攻毒。
              結果:經過2周的感染,投喂沒有卵黃抗體的餌料的蝦苗出現肌肉壞死癥狀達到65%; 已經投喂了有卵黃抗體餌料一周的蝦苗沒有出現肌肉壞死癥狀,免疫保護率達到100%,表明 制備的卵黃抗體具有保護蝦體,使其免受病毒入侵。

              關 鍵 詞:
              一種 羅氏沼蝦野田 病毒 蛋白 卵黃 抗體 及其 應用
                專利查詢網所有資源均是用戶自行上傳分享,僅供網友學習交流,未經上傳用戶書面授權,請勿作他用。
              0條評論

              還可以輸入200字符

              暫無評論,趕快搶占沙發吧。

              關于本文
              本文標題:一種羅氏沼蝦野田病毒衣殼蛋白卵黃抗體及其應用.pdf
              鏈接地址:http://www.039244.fun/p-1723119.html
              關于我們 - 網站聲明 - 網站地圖 - 資源地圖 - 友情鏈接 - 網站客服客服 - 聯系我們

              [email protected] 2017-2018 zhuanlichaxun.net網站版權所有
              經營許可證編號:粵ICP備17046363號-1 
               


              收起
              展開
              大连码头渔歌酒楼

                  <progress id="rrzp7"></progress>
                    <big id="rrzp7"><meter id="rrzp7"></meter></big>
                      <progress id="rrzp7"><menuitem id="rrzp7"></menuitem></progress>

                        <big id="rrzp7"><menuitem id="rrzp7"></menuitem></big>

                        <progress id="rrzp7"></progress>

                              <progress id="rrzp7"></progress>
                                <big id="rrzp7"><meter id="rrzp7"></meter></big>
                                  <progress id="rrzp7"><menuitem id="rrzp7"></menuitem></progress>

                                    <big id="rrzp7"><menuitem id="rrzp7"></menuitem></big>

                                    <progress id="rrzp7"></progress>